热原检查法【研究知识】_第1页
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文档简介

1、,第三节 热原检查法,1,行业倾力,热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。 它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。 这里所指的“热原”,主要是指细菌性热原,是某些细菌的尸体及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原,致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物,其次是革兰阳性杆菌类,革兰阳性球菌则较弱,霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。它的化学结构是脂多糖和微量蛋白的复合物,热原的定义,2,行业倾力,热原与细菌内毒素的区别,热原物质包括了细菌内毒素,细菌内毒素是众多热原物质中的一种,也是最主要的一种。 一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。不

2、是每一种热原都具有脂多糖的结构,但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。在药品生产质量管理规范(GMP)条件下,药品生产的质量控制一般可以接受的观点是:不存在细菌内毒素意味着不存在热原。,3,行业倾力,热原除具有很强的致热性外,还具有下列性质: 耐热性:1802小时以上或25030min以上才能彻底破坏热原。因此,玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的注射器等,均可用高温破坏热原。 水溶性:热原能溶于水,可用大量无热原注射用水冲洗以除去热原。 不挥发性:热原本身不挥发,但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水中,故用蒸馏法制备注射用水时,蒸馏水器应有隔离装置。 滤过性:热原体积极小,直径150nm,

3、可通过普通滤器进入滤液中。 不耐强酸、强碱、强氧化剂:热原能被盐酸、硫酸、氢氧化钠、高锰酸钾、重铬酸钾等所破坏。,热源的性质,4,行业倾力,热原反应:热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约0.51小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高热者。病人体温迅速上升,在24小时体温上升至高峰,一般在3940,严重者高达41以上,病人面色潮红、头痛、恶心、呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。,热原的危害,5,行业倾力,热原检查法的定义,本法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原

4、的限度是否符合规定,6,行业倾力,试验用的注射器、针头及 一切和供试品溶液接触的耐高 温器皿,应置烘箱中用250加 热30分钟(英国药典2001h) 不耐高温器皿可置于30 双氧水中浸泡4h,再用细菌内 毒素检查用水充分冲洗,60 烘干备用,实验耗材去热原,7,行业倾力,实验动物的选择,8,行业倾力,9,行业倾力,抓取兔子的正确方法:一手抓持兔颈背部皮毛,一手托起兔臀部。 在热原检查前12日,供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于3,在试验全部过程中,应注意室温变化不得大于3。 应避免噪音干扰。 整个试验操作过程应尽量轻柔,避免激惹动物,造成体温大幅波动,影响

5、结果。 家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。 读取体温:一手拿住体温计尾部,使眼与体温计保持同一水平,然后慢慢地转动体温计 ,从正面看到水银柱时就可读出相应的温度值 ,切记不可用手碰触水银球端 静脉给药前需将供试品温热至38(美国药典372,英国药典38.5),注射要缓慢。,注意事项,10,行业倾力,1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,使其适应试验环境,饲养温度与环境温度相差3。 2.每隔30分钟测量体温1次,一般测量2次(英国药典测4次,但前2次舍去),两次体温之差不得超过0.2,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38

6、.039.6的范围内,且各兔间正常体温之差不得超过1。两次体温的平均值作为兔的正常体温。 2、测定其正常体温后15分钟以内,自耳静脉缓缓注入规定剂量(10ml/kg)并温热至约38的供试品溶液. 3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。 4.以6次体温中最高的一次减去正常体温,即为该兔体温的升高度数,当动物升温为负值时,以0计算。,初 试,11,行业倾力,初试结果判断:,12,行业倾力,复试及结果判断:,13,行业倾力,传统热原检测方法的不足,内毒素法:,家兔法:,费用高 结果重复性差 使用活体动物实验,只能检测细菌内毒素 鲎(hu)资源日益匮乏,14,行业倾力,15,行业倾力,鲎(

7、hu)亦称马蹄蟹。肢口纲(Merostomata)剑尾目(Xiphosura)海生节肢动物,共4种,见于亚洲和北美东海岸。虽又称马蹄蟹,但不是蟹,而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。 鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫 (现在只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪,当时恐龙尚未崛起,原始鱼类刚刚问世,随着时间的推移,与它同时代的动物或者进化、或者灭绝,而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鲎有“活化石”之称。,蓝血的活化石-鲎,16,行业倾力,鲎具有很高的药用价值,,它的血液中含有铜离子,它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的

8、提取物“鲎试剂”,可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病;在制药和食品工业中,可用它对毒素污染进行监测。科学家也使用鲎血研究癌症。但是,对鲎抽血后,它们就被放生,17,行业倾力,随着各种新技术产品的出现及现有方法存在的问题,传统热原检测方法日趋落后,不适应于产品的热原检测。,18,行业倾力,外热原 人体(分泌内热原) 体温调节中枢 发热,新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体,通过检测内源性热原(主要为细胞因子,如IL-6、IL-1、TNF-)在体外进行热原检测。,新方法原理,细胞(分泌内热原),19,行业倾力,国外对新方法的研究始于20世纪80年代,国际发达国家实验室,包括英国国家生物制品检定所NIBSC、德国国家疫苗及血清研究所PEI等,均对新的体外热原检测替代方法开展了研究。,新方法国外研究现状,20,行业倾力,2010版欧洲药典已收录了5种新体外热原检测方法: 人新鲜全血IL-1法 人新鲜全血IL-6法 人冻存全血IL-1法 MM6细胞IL-6法 PBMC细胞IL-6法,21,行业倾力, 不使用动物进行体内实验 能真实地模拟人体对热原的反应 能检测非内毒素热原 能定量或半定量 能被广泛地应用 操作简单可行,新方法优点,22,行业倾力,新方法国内研究现状,国内对新方法的研究与国际

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