MCM_41固载牛血清白蛋白复合材料的制备_表征及发光_魏宇辰

1、第 41 卷 第 6 期人工晶体学报Vol 41 No 62012 年 12 月JOURNAL OFSYNTHETICCRYSTALSDecember，2012MCM-41 固载牛血清白蛋白复合材料的制备、表征及发光魏宇辰，翟庆洲( 长春理工大学纳米技术研究中心，长春 130022)摘要: 本研究首先利用水热法制备出了纳米分子筛 MCM-41，然后把牛血清白蛋白( Bovine serum albumin，BSA) 物理吸附法固载在主体 MCM-41 中，制备出 ( MCM-41) -BSA 复合材料。化学分析表明，BSA 已进入上述主体材料中，固载量为 55 68 mg ( BSA) /g

2、( MCM-41) 。粉末 X 射线衍射( XRD) 结果表明，复合材料的结晶度保持良好，分子筛的基本骨架保存完好没有由于 BSA 的引入而遭到破坏。77 K 低温 N2 吸附-解吸附的研究结果说明，BSA 部分进入了分子筛孔道中。扫描电镜( SEM) 测量结果显示，( MCM-41) -BSA 样品的直径为 100 10 nm。发光研究表明，( MCM-41) -BSA 样品中 BSA 的构象未发生变化。关键词: 纳米 MCM-41; 牛血清白蛋白; 吸附中图分类号: TN213文献标识码: A文章编号: 1000-985X( 2012) 06-1613-06Preparation，Char

3、acterization and Luminescence of MCM-41 Immobilized Bovine Serum Albumin Composite MaterialWEI Yu-chen，ZHAI Qing-zhou( Research Center for Nanotechnology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China)( Received 24 July 2012，accepted 30 August 2012)Abstract: In this research，n

4、anoscale MCM-41 molecular sieve was prepared using hydrothermal method and then bovine serum albumin ( BSA) was immobilized in the above host to prepare ( MCM-41) -BSA composite materials by physical adsorption method Chemical analysis showed that BSA had entered into the above-stated host material

5、and its immobilization amount was 55 68 mg ( BSA) /g ( MCM-41) Powder X-ray diffraction( XRD) results indicated that crystallinity degree of composite materials was maintained good and basic frameworks of the molecular sieve were preserved intact and were not destructed due to BSA introduction Thelo

6、w temperature N2 adsorption-desorption study results at 77 K showed that BSA had already partially entered in the molecular sieve pore channels The measurement results by scanning electron microscopy ( SEM)displayed that the diameter of ( MCM-41) -BSA sample was 100 10 nm The luminescence study show

7、ed that in the ( MCM-41) -BSA sample the conformation of BSA was not changed Key words: nanoscale MCM-41; bovine serum albumin; adsorption收稿日期: 2012-07-24; 修订日期: 2012-08-30基金项目: 吉林省自然科学基金项目资助( 201215146，242920，KYC-JC-XM-2012-059)作者简介: 魏雨辰( 1986-) ，女，吉林省人，硕士。通讯作者: 翟庆洲，教授。E-mail: zhaiqingzhou 163 com1

8、614人 工 晶 体 学 报第 41 卷1 引言某些生物大分子的分离如蛋白质的分离，在许多行业特别是在食品制造业，具有非常重要的意义。需要分1离具有相同物理、化学性质的蛋白质，则需要理想的高选择性吸附剂 。由于介孔材料独特的孔道结构和大的2-4。所构筑的复合杂化材料，比表面积，在有序多孔及介孔材料上吸附酶的研究，引起了科学家们的极大兴趣具有作为高选择性催化剂之潜力与应用前景。产生的这类无机-有机杂化材料，介孔载体开孔性被修饰，接着在，()1，其孔道内架构生物催化剂 可以考虑用作“生物反应器 Bioreactor ” 。近年来 具有可控形貌、孔道规则排列及高表面积以及良好化学稳定性及热稳定性介孔

9、二氧化硅材料合成取得了巨大进展，使得二氧化硅基质材料在纳米尺度限域空间内作为吸附和固载生物分子的载体，产生了高度的吸引力。在限域空间内对蛋白酶固载可以降低酶的自身分解，也可以降低蛋白质酶的聚集，可以提高吸附在分子筛上的酶分子的分离性能，在通常1。自从 20世纪 905，6情况下，可以提高固载酶的稳定性年代初，Beck 等报道发现了 M41S 系列分子筛后，这个领域已经取得了令人瞩目的进展。M41S 系列有比较大的、均一的孔径 ( 2 50 nm) ，高的表面积( 高达 1000 m2 /g) ，高度有序的孔道结构和狭窄的孔径分布，这些有趣的特性使它们在分离技术、多相催化和生物医学上789报道了

10、细胞色素 C 在 MCM-41得到广泛的应用。Yiu 等研究了胰岛素在 MCM-41 中的固载。Deere 等上的吸附。Kisler10报道了两种蛋白质，溶解酶和胰岛素在 MCM-41、MCM-48 上的吸附实验。他们发现等MCM-41 比 MCM-48 显著提高了对蛋白质的吸附，并认为这是由于两种分子筛的孔径不同而引起的。血清白蛋白是血液中蛋白的主要成分，在特定条件下，倾向于自我装配形成大的聚集体，被广泛用于研究蛋白的折叠、聚集以及生物技术上应用的模型。在循环系统中，白蛋白是最丰富的蛋白质，大约占血浆蛋白含量的 60% ，为血液提供了 80%11，维持血液的 pH 值主要由血清白蛋白负责。B

11、SA 由 583 个的渗透压11见表 1。Cai 等 2001年合成了纳米 MCM-4112。残基组成，分子量 68000。BSA 的基本性质介孔分子筛预期在纳米 MCM-41 中固载 BSA，可以提高固载酶的稳定性，制备的复合材料具有作为生物催化剂的潜在应用前景。本文采用牛血清白蛋白( BSA，bovine serum albumin) 作为蛋白质模型，进行蛋白质吸附研究并进行详细表征，探讨其发光性质。通过化学分析、傅里叶变换红外光谱、粉末 X 射线衍射、77 K 低温 N2 吸附-解吸附研究、扫描电镜及透射电镜对所制备的材料进行了表征，探讨了复合杂化材料( MCM-41) -BSA 的发光

12、。表 1牛血清白蛋白的基本性质Table 1Basic properties of BSAProtein nameMolecular weight Da /DaltonsIsoelectric point /pIMolecular dimension /nmBSA66 4004 75 0 7 0 7 02实验2 1材料牛血清白蛋白 ( BSA，中国惠世生化试剂有限公司) ; 正硅酸乙酯 ( TEOS，中国医药上海化学试剂有限公司) ; 十六烷基三甲基溴化铵 ( CTMAB，北京益利精细化学品有限公司) ; 氢氧化钠 ( 北京化工厂) ; 二次去离子水; 实验所用试剂均为分析纯。2 2介孔 MC

13、M-41 分子筛的制备向 480 mL 水中加入 1 0 g CTMAB，在磁力搅拌下，加入 3 5 mL 的 2 0 mol /L 的 NaOH 溶液，待匀相溶液形成，缓慢滴加 5 mL 的 TEOS，使混合溶液保持在 80 ，强力搅拌 2 h，然后过滤，用水洗涤，待样品自然干燥后，置于马弗炉中，550 下煅烧 4 h，就得到了纳米 MCM-4112。分子筛2 3 在 MCM-41 内固载 BSA取 0 25 g 煅烧后的 MCM-41 分子筛，加入 4 mg /mL 的 BSA 溶液 5 mL，加 pH 为 4 5 的 HAc-NaAc 缓冲液 5 mL，于 4 震荡吸附 24 h。将混合

14、体系以 5000 r /min 的速度离心，保留上清液，用水洗涤沉淀，直到在14测定上清液中溶液中检测不到 BSA 为止，得到上清液和沉淀，合并上清液。采用偶氮胂-III 分光光度法第 6 期魏宇辰等: MCM-41 固载牛血清白蛋白复合材料的制备、表征及发光1615酶蛋白质含量，差减法计算吸附在分子筛中蛋白质酶的含量:吸附酶蛋白量 = 酶蛋白总量 上清液中酶蛋白量( 1)条件优化实验，分别按以下方法进行:其它条件固定不变，在不同 pH 值的缓冲液中进行 BSA 的固载化研究，取 pH 为 4 0、4 5、4 8、5 0、6 0。计算 1 g 分子筛 MCM-41 吸附 BSA 的量。其它条件

15、固定不变，BSA 在 MCM-41 或甲基化 MCM-41 中分别吸附震荡 2、6、12、20、24、36、48 h，计算 1g 分子筛 MCM-41 及甲基化 MCM-41 吸附 BSA 的量。其它条件固定不变，在不同浓度的 BSA 溶液中进行 BSA 的固载化研究，取浓度为 2 mg /mL、3 mg /mL、4mg /mL、5 mg /mL、6 mg /mL。计算 1 g 分子筛 MCM-41 吸附 BSA 的量。2 4表征13，()采用偶氮胂-分光光度法测定 BSA 含量 722S 型分光光度计 上海棱光技术有限公司 配 l cm 比色皿用于吸光度测量。傅里叶变换红外光谱( FT-IR

16、) : 使用的是 BRUKER Vertex-70 型光谱仪 ( 美国 Mike 公司) ，KBr 压片技术。粉末 X 射线衍射分析( XRD) : 在德国 Bruker 公司的 D8/ADVANCE 衍射仪上进行，CuK 靶，波长 0 154 nm，电压 30 kV，电流 20 mA，2 值从 0 4到 10，步长为 0 02 ( 小角) 或者 2 值从 10到 80、步长为 0 2 ( 广角) 。 77 K 低温 N2 吸附-解吸附研究: 77 K 下，ASAP 2020 MV3 01 H 吸附仪 ( 美国 Micromeritics 公司) 上测出样品粉末的比表面积和孔体积，样品在室温下

17、抽真空 2 h，室温抽真空，以防止蛋白质变性，样品比表面积用 BET ( Brunner-Emmett-Teller) 法14测出，样品的孔结构用 BJH ( Barrett-Joyner-Halenda) 法15分析。扫描电子显微镜照片( SEM)在 PHILIPS XL30 型场发射扫描电子显微镜上拍照获得。透射显微镜 ( TEM) 照片采用 FEI Tecnai G2 F20 型场发射透射电子显微镜 ( 工作电压 200 kV) 实验获得。发光研究: 在室温 20 下，在美国 SPEX 公司的 SPEX-FL-2T-2型双光栅荧光光谱仪上完成荧光光谱的测量。3 结果与讨论不同浓度的 BS

18、A 对吸附实验结果影响结果，示于图 1。随着 BSA 浓度增加，其吸附量逐渐增大( 0 4 mg /mL) ，之后，吸附达到平衡( 4 6 mg /mL) ，实验选取 4 mg /mL。绘制不同时间、不同 pH 值 BSA 在主体材料上的吸附固载曲线，如图 2 所示。在 pH 4 5 酸度下，BSA 在 MCM-41 上的吸附量最大，这与 BSA 的等电点 pH 4 7 4 9 相吻合。最大吸附，发生在 BSA 等电点 ( pH = 4 7) 附近 pH = 4 5 之处; 在这种情况下，BSA的表面上，无净电荷，BSA 和 MCM-41 表面之间，静电排斥力最小。此时，固载量为 55 68

19、mg ( BSA) /g()，16，1718MCM-41 。各种 SiO2 材料 等电点为 0 5 3 7 。MCM-41 的等电点为 3 42 3 77 。随着 pH 值的增加，由于 BSA 与 MCM-41 表面的静电排斥力作用增强，吸附量降低。有关 BSA 蛋白质在二氧化硅分子筛 MCM-41 表面吸附有贡献的驱动力，源于静电力、氢键以及疏水作用，但由于蛋白质分子的高度复杂性，应认为，这种 BSA 和 MCM-41 之间的结合力，主要是这些作用力的协同作用之结果。图 1不同浓度的 BSA 在 MCM-41 上的吸附图 2不同时间、不同 pH 对 BSA 吸附影响Fig 1Adsorpti

20、on of different concentration BSA on MCM-41Fig 2Effect of different time，different pH on BSA adsorption1616人 工 晶 体 学 报第 41 卷图 3 为 BSA、MCM-41、( MCM-41) -BSA 样品的小角的 XRD 图。在 b 曲线中，出现一个较强的衍射峰 d( 100) ，较弱的衍射峰 d( 100) 、d( 200) 和 d( 210) 也都清晰可见，这是 MCM-41 介孔分子筛典型的二维六角结构的特征衍射峰12。从曲线 c 可看出，( MCM-41) -BSA 样品出现

21、了 MCM-41 分子筛的特征衍射峰( 100) ，但( 110) ， ( 200) ，( 210) 衍射峰消失，表明所制备的复合材料中 MCM-41 分子筛骨架保存完好，但复合材料分子筛骨架有序度降低。经计算得到的 d( 100) 值和晶胞参数 a0 列于表 2。图 4 为 BSA、MCM-41、( MCM-41) -BSA 样品的广角 XRD 衍射图谱，可看出( MCM-41) -BSA 样品与 MCM-41 相比，出现了 MCM-41 分子筛的特征衍射峰，进一步说明所制备的复合材料中 MCM-41 分子筛骨架保存完好。图 3样品的小角 XRD 图谱Fig 3Small angle XRD

22、 patterns of samples:( a) BSA; ( b) MCM-41; ( c) ( MCM-41) -BSA图 4样品的广角 XRD 图谱Fig 4Wide angle XRD patterns of samples:( a) BSA; ( b) MCM-41; ( c) ( MCM-41) -BSA图 5( a) 样品低温 N2 吸附-解吸附图; ( b) 孔径分布曲线 ( 吸附; 脱附 )Fig 5( a) Low temperature N2 adsorption-desorption patterns of samples; ( b) Pore size distri

23、bution patterns图 5 显示煅烧后的 MCM-41 以及杂化材料( MCM-41) -BSA 样品在 77 K 时，N2 吸附-解吸附等温线及其孔径分布图。由图 5( a) 可知，MCM-41、( MCM-41) -BSA 样品的低温 N2 吸附-解吸附等温线与滞后环分别相似，二者都显示出典型的 IV 型吸附等温线及 H1 型滞后环，说明引入 BSA 后分子筛 MCM-41 的孔道结构没有被破坏，仍呈现圆柱型孔道类型。从 N2 吸附-解吸附曲线上看，吸附前后的样品都出现三个阶段，并且和介孔材料的吸附特点十分吻合。( MCM-41) -BSA 的样品比未吸附的 MCM-41 样品发

24、生突跃的相对分压范围小，因为样品吸附后客体 BSA 部分进入了分子筛的孔道中，并占据一部分的孔容，使得发生吸附的相对分压范围与未吸附的 MCM-41 样品相比，有所减小。从 N2 吸附-解吸附曲线上看，吸附前后的样品都出现三个阶段，并且和 MCM-41 的吸附特点十分吻合。由于 BSA 分子部分地占据了 MCM-41 孔道，导致孔体积从 0 566 cm3 /g 降低到 0 466 cm3 /g，降低了 17 7% ; BET 比表面积从 960 9 m2 /g 降低到 906 2 m2 /g，降低了 5 7% ; 这些结果表明，BSA 分子部分进入了 MCM-41 孔道中。上述可知，部分 B

25、SA 限域在 MCM-41 孔道内。图 5( b) 是 MCM-41、( MCM-41) -BSA 样品孔径的分布图，从图中可以看出: ( MCM-41) -BSA 样品的孔径与未经吸附 BSA 的 MCM-41 相比，略有减小。有关样品的孔结构参数及相关物理化学参数，列于表 2 中。第 6 期魏宇辰等: MCM-41 固载牛血清白蛋白复合材料的制备、表征及发光1617图 6 为所制备的样品的扫描电子显微镜照片，可以看出，复合材料样品( 6b) 的形貌主要呈圆球形的晶粒结构，其直径在 100 10 nm。图 7 是所制备样品的 TEM 图，该样品具有有序的蜂窝状孔道结构。( MCM-41) -

26、BSA) 样品( 7b) 呈现二维六方有序介孔孔道排列，孔道条纹清晰有序，说明制备的( MCM-41) -BSA) 样品仍呈现介孔材料结构性质。为探讨 BSA 在复合材料中，构象是否有发生变化，进行了发光研究。图 8 为样品的激发和发射光谱。 MCM-41 本身在该条件下不具备发光特性。( MCM-41) -BSA 发射光谱峰出现在 438 nm 处，与 BSA 发射峰基本一致。复合材料的发光机理，可归属为 BSA 发光。这表明 BSA 在复合材料中构象没有被改变，仍保持了蛋白酶活性。表 2样品的孔结构参数Table 2 Pore structure parameters of samples

27、Sample(Nanometer MCM-41)( MCM-41) -BSAComposite hybridmaterial ( MCM-41) -BSAInterplanar spacing，d100 /nm33 455 1Unit cell parameter，a0a /nm38 563 6BET Specific surface area /m2 g 1960 9906 2Pore volume b /cm3g 10 5660 466Pore size c /nm3 552 69Pore wall thickness d /nm15 660 9Content of BSA( BSA /m

28、olecular sieve)/mgg 1 g055 68注: a-晶胞参数Unit cell parameter:0=2d 100槡3b- BJH 为吸附累积孔体积BJH adsorption cumulative volume of poresc-由吸附曲线计算出的孔尺寸Pore size calculated from the adsorption branchd-晶胞参数( a0 ) -孔尺寸( 最可几孔径) = 孔壁厚Wall thickness calculated by ( a0 - pore size) 图 6样品扫描电子显微镜图图 7样品的透射电子显微镜图Fig 6SEM i

29、mages of samples ( a) MCM-41;Fig 7TEM images of samples ( a) MCM-41;( b) ( MCM-41) -BSA( b) ( MCM-41) -BSA图 8样品的发光光谱Fig 8Luminescent spectra of samples ( a) excitation spectrum; ( b) emission spectrum1618人 工 晶 体 学 报第 41 卷4结论采用物理吸附法成功地将牛血清白蛋白固载在纳米 MCM-41 中。粉末 XRD 及 HRTEM 表征结果说明，( MCM-41) -BSA 复合材料中，M

30、CM-41 结构得以保持。化学分析结果证明，BSA 已吸附在 MCM-41 中，最大固载量为 55 68 mg ( BSA) /g ( MCM-41) 。低温 N2 吸附-解吸附说明，部分 BSA 处于分子筛介孔内。复合材料( MCM-41) -BSA 呈圆球形，尺寸为 100 10 nm。( MCM-41) -BSA 复合材料在发光、催化等领域中具有潜在应用前景。参考文献1234Hartmann M Ordered Mesoporous Materials for Bioadsorption and BiocatalysisJ Chem Mater ，2005，17( 18) : 2577-

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