气相色谱-质谱法检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子编制说明

1、气相色谱-质谱法检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子编制说明一、工作简况 任务来源：原内蒙古质监局关于下达2018年第二批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内质监标函2018154号） 起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院 起草人：孙海洲、李胜利、张春华、桑丹、金鹿、张崇志、凌树礼、任晓萍、珊丹。二、制定标准的目的和意义群体感应(Quorum sensing,QS)是微生物通过分泌信号分子来感知环境周围同类数量的行为，当环境信号分子达到一定浓度阈值时，通过调控特定基因的表达，以达到协调微生物群体行为的目的。研究表明，革兰氏阴性细菌中群体感应信号分子主要为酰基高丝氨酸内酯类( Acyl-hom

2、oserine lactones，AHLs) 。AHLs 在革兰氏阴性菌许多生理过程中发挥着重要作用，比如：病原细菌胞外酶和毒素的产生、生物膜的形成、生物发光、色素产生、抗生素形成和细菌运动等等。目前，在通常情况下细菌所产生的AHLs 浓度极低，因此需要建立快速、有效的检测细菌中AHLs 的方法，为研究细菌群体感应系统提供重要研究手段。对AHLs 信号分子检测方法主要有酶联免疫、生物传感器、薄层层析、和色谱方法。其中，生物传感器和薄层层析是分析AHLs 化合物最常用的方法，但只能进行定性分析。其中，生物传感器检测每种AHLs 均需要特定的菌株和质粒，且完成测定需要1d 的时间。色谱法但由于其能

3、够准确分析多种AHLs，是近年来新出现的检测AHLs 的新方法，应用也越来越普遍。气相色谱-质谱法可以快速有效的进行革兰氏阴性细菌中AHLs检测，为研究革兰氏阴性菌的群体感应系统提供了有效手段，同时为抑制有害微生物和替代抗生素的研究提供基础依据，因此由内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所制定和起草了“气相色谱-质谱法检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子”标准。三、主要起草过程1. 标准的制定过程本标准由内蒙古自治区农牧业科学院的科研工作人员，在查阅国内外相关资料报道的革兰氏阴性菌群体感应信号分子测定方法后，通过对样品的前处理方法、气相色谱条件的选择进行摸索并改进，使用热电DSQ 单四级杆气

4、相色谱质谱联用仪，对采集的瘤胃液和肠道食糜样品进行了酰基高丝氨酸内酯信号分子的测定，最终制定出“气相色谱-质谱法检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子”标准。2. 工作过程2018年3月开始查阅国内外相关文献，确定实施方案，2018年6月份购买了测定试验所需的化学试剂，从2018年11月到2019年9月根据实施方案的具体要求，开展以下几方面的研究工作：一是组织实验室相关人员对采集的瘤胃液和肠道食糜样品进行酰基高丝氨酸内酯信号分子含量的测定；二是依据测定结果来判断该方法的可重复性和准确度的高低；三是将测得的结果与国内外其他相关研究的测定结果进行比较。该研究中建立起的关于瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内

5、酯信号分子的测定方法，为研究革兰氏阴性菌的群体感应系统提供了有效手段，同时为抑制有害微生物和替代抗生素的研究提供基础依据。四、标准编制原则和依据（一）标准编制原则本标准严格按照GB/T1.1-2009标准化工作导则第一部分标准的结构和编写规则进行编写的。在制定本标准的过程中，汲取国内外同类标准先进生产技术及编制的先进经验和方法，力求以实事求是的原则使本标准具有较强的科学性、先进性、可靠性和可操作性。目前国内外还没有对细菌信号分子测定方法建立标准，因此本标准参考了GB/T 9695.2-2008 肉与肉制品 脂肪酸的测定、GB 29685-2013 食品安全国家标准 动物性食品中林可霉素、克林霉

6、素和大观霉素多残留的测定 气相色谱质谱法和农业部958号公告-10-2007 水产品中雌二醇残留量的测定 气相色谱质谱法测定方法内容对本标准表述进行了修改，增加了检出限和回收率等部分内容表述。（二）主要技术内容确定的依据在进行大量试验研究的基础上，参考国外、国家、地方标准和行业标准的相关内容，对实验室的设备、化学试剂的纯度规格、测定方法及操作规程，都做了具体要求。五、技术标准的编写说明为了确保起草好本标准，工作人员首先确定了本标准中所涉及的技术内容不仅具有科学性、先进性，而且要更具有精准性、实用性和可操作性。因此在编写内容的安排上充分考虑了测定装置及测定方法将会极大地直接影响酰基高丝氨酸内酯信

7、号分子含量测定的可靠性和准确性。在测定仪器的选择上最终选用热电DSQ 单四级杆气相色谱质谱联用仪，并在测定过程中针对瘤胃液和食糜的特点，通过反复试验优化了试样制备方法，极大的减小了对试验结果的影响。该方法的建立可为瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内酯信号分子含量的准确测定提供技术保障，这正是编写本标准需要预期达到的目的。本标准以多年实验研究工作为基础并借鉴了国内外测定瘤胃液和环境中酰基高丝氨酸内酯信号分子含量的方法的相关文献和先进成果编制而成，在具体技术操作方面以广大专业科研测试者的工作人员为主体，技术部门辅助协作共同实施。六、标准主要内容的说明本标准的主要内容由三个部分组成，即1.范围；2.名

8、词术语解释；3. 应用气相色谱质谱联用仪测定瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内酯方法，下面重点予以说明。1 对范围的描述本标准规定了应用气相色谱测定瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内酯信号分子含量的方法。本标准适用于瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内酯含量的测定。2 对名词术语解释的描述名词及术语的解释主要针对群体感应和酰基高丝氨酸内酯的解释，目的是让测试的工作人员有一个正确的认识和了解。3 对应用气相色谱质谱测定瘤胃液和肠道食糜中酰基高丝氨酸内酯方法的描述本标准中主要规定了应用气相色谱质谱联用仪测定瘤胃液和肠道食糜中革兰氏阴性菌信号分子酰基高丝氨酸内酯的具体方法。七、 贯彻实施标准的要求及措施本标

9、准在经相关部门批准后，建议作为推荐性标准发布实施。“标准”在执行的过程中还需要不断的完善和健全。八、 专家意见采纳情况 本标准在撰写完成后，送给相关行业专家征求意见。征求意见后，按照专家意见进行了修改完善。英文标题修改为“The test method for quorum sensing molecules of gram-negative bacteria by gas chromatography-mass spectrometry”，对编制说明中补充了汲取国内外标准的情况以及一致性情况，删除“2. GB/T 1.1 标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则条款”内容，“4.试剂”修改为“4.试剂和材料”，并注明色谱纯试剂及分析纯试剂，完善4.15.14.15.2标准工作曲线，5.5修改为“5.1气相色谱质谱联用仪，配有电子轰击源（EI源）”，7.2.1色谱条件删除“检测器:FID(氢火焰离子检测器) ”，对色谱质谱条件进行重新表述，增加“增加7.4 平行试验”、“7.5 空白试验”，增加定量限和回收率内容，增加“附录A 色谱图”、“附