血管增生疾病

血管增生性疾病的分子基础,1,第一节 血管增生和血管增生性疾病一、血管增生的概念 ：从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程在创伤和外周循环闭塞情况下具有恢复血供和促进 伤口愈合的积极作用 肿瘤和血管增生性眼病等疾病的主要病理特征之一,2, 以血管增生为靶点正成为治疗恶性肿瘤和其他血 管增生性疾病的研究热点 血管生成是一个复杂的过程，包括选择性降解血 管基膜和周围的细胞外基质、内皮细胞增殖和迁 移、最后形成毛细血管芽。,3,二、血管增生性疾病肿瘤 血管增生与肿瘤生长 实体性肿瘤的生长依赖于血管增生新生血管长入前呈线性增长（血管前期或浸润前期） 新生血管长入肿瘤即呈指数生长（肿瘤血管期）,4,新生血管长入不仅提供肿瘤生长需要的营养物质和 氧气以及带走代谢废物，还为肿瘤细胞提供生长因 子如FGF-1和FGF-2等机械性阻断或应用血管增生抑制剂剥夺肿瘤的血供 显著抑制甚至完全阻止肿瘤的生长,5,血管增生与肿瘤转移 血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且还是肿瘤细 胞发生转移所需要新生毛细血管的内皮细胞能分泌胶原酶和组织纤溶 酶原激活物，促进基质降解，便于肿瘤细胞脱落进 入血管和向邻近基质扩散血管前期，循环中极少有肿瘤细胞，但在肿瘤血管 化后，肿瘤细胞才持续出现在循环中,6,新生血管性眼病 眼表新生血管性病变 全球1000万，中国100万 糖尿病性视网膜病变 美国有糖尿病患者近两千万人，糖尿病史超过十 年者约50%并发视网膜病 新生血管性眼病已成为西方国家致盲的首位因素,7, 糖尿病性视网膜病变,8,角膜新生血管 正常角膜无血管，病理状态下，毛细血管会从角膜 缘血管网侵入角膜，引起角膜新生血管 原因：佩戴角膜接触镜、眼外伤和既往手术史、感 染性和免疫性眼病、碱烧伤等 新生血管对感染的消除、创伤的愈合、抑制免疫反 应介导的角膜溶解等有一定作用，但结构脆弱，易 渗透，常由于出血渗出及继发的纤维化等导致失明,9,虹膜新生血管 虹膜新生血管并非虹膜的原发病，它通常继发于许 多眼其他部位的疾病和全身性疾病 主要的病因有视网膜中央静脉阻塞和糖尿病 导致失明和眼球摘除的常见原因 在美国，每年约有12%-15%的眼球摘除病例是由于 虹膜新生血管引起的失明和疼痛所致,10,第二节 血管增生的分子机制一、新生血管形成的平衡假说,11,根据这一理论，抑制新生血管的策略有： 拮抗血管生成刺激因子 应用血管生成抑制因子 以纠正病理性平衡失调,12,拮抗血管生成刺激因子拮抗血管增生刺激因子主要围绕对VEGF的阻断中和VEGF的单克隆抗体已进入临床II/III期试验 獒合VEGF受体2的单克隆抗体进入临床I期试验VEGF抗体、VEGF受体的螯合蛋白及反义寡核苷酸 显著抑制视网膜和虹膜血管增生存在问题：只阻断VEGF的作用仅能部分抑制肿瘤 和血管增生性眼病的血管新生；阻断VEGF的正常 生理作用,13,应用血管生成抑制因子目前国外有300多种抑制血管增生的药物处于临床试验的不同阶段，这类药物大致可以分为5大类：（1）抑制基底膜降解的药物；（2）直接抑制内皮细胞的药物；（3）抑制血管生长因子活化的药物；（4）抑制内皮细胞特异性整合素/生存信号的 药物；（5）其他机理不明但有抗血管增生作用的药物,14,作用于血管内皮细胞的内源性抑制因子是研发焦点：作用于血管内皮细胞，副作用小，不会产生抗药性仅作用于增殖的血管内皮细胞，抑制新生血管，对 已有正常血管无影响研究最早的两个内源性血管增生抑制因子： Angiostatin、Endostatin成功用于肿瘤生长抑制 的实验研究，FDA于1999年批准进行治疗实体瘤I期 临床试验（EntraMed 公司）James Watson 预言人类将在两年内治愈癌症,15, Endostatin作用受到质疑：两个独立的课题组将Endostatin基因导入小鼠体内， 在体内得到了高表达，但高表达的Endostatin既未 能阻断血管增生也未能抑制肿瘤生长在美国已进行的不到200例病人中至今无一例治愈或 效果显著的报告 ，临床试验结果不理想美国FDA取消了扩大Endostatin临床试验例数的计划 2002年3月Science 发表评论“setbacks for endostatin”， 认为Endostatin的作用仍具有不确定性，尚需更多的 研究来明确Endostatin自身及其作用 机制,16, 现有内源性抑制因子存在问题：分子量大，性质不稳定；原核表达体系多为无活性、 不溶性蛋白沉淀基因治疗较直接应用活性多肽的途径效果差 分子机制不明确：结构和功能的关系尚需深入研究； 特异性受体尚未分离出来 ；胞内信号转导通路不清,17,二、血管新生刺激因子血管新生刺激因子包括表皮生长因子（EGF），碱 性成纤维生长因子（bFGF），转化生长因子（TGF），血小板源生长因子（PDGF），胰岛素样生 长因子（IGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等 VEGF作为最强的内皮细胞特异性刺激因子，在多种 血管增生性眼病中起核心作用以VEGF作为刺激因子的代表，介绍其在血管生成中 的作用和分子机制,18,1. VEGF结构特征VEGF在染色体上定位于6p，为单一基因，长度为 14kb，含8个外显子和7个内含子VEGF通过两对链间二硫键形成反平行同型二聚体 转录时mRNA可剪接成5种异构体，分别为VEGF121、 VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206异构体之间功能上的差异表现为它们与细胞表面和 细胞外基质中肝素结合活性不同,19,VEGF165具有肝素结合活性，约50%以可溶性形式分 泌至细胞外，其余的部分和细胞膜或基底膜上含有 肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合 VEGF165这种可溶与不溶的形式似乎更符合机体对 血管形式应答调节机制，当机体需要时，即以较 大限度的可溶性形式存在；一旦血管形成应答 过度，又以不溶形式结合到基膜上，减少其危害； VEGF165体内表达丰度最高，也是体外研究中主要 的生物学活性形式,20,VEGF121为可溶性分泌蛋白，不与肝素结合，易自由 扩散 VEGF189和VEGF206活性相同，与肝素结合活性很高， 几乎完全与细胞和细胞外基质结合，在细胞外液 中测不到溶解游离形式虽然5种异构体均能诱导体内的血管生成，但不同 情况下每种异构体发挥不同的优势，何种类型的细 胞产生何种VEGF异构体尚待研究,21,2.VEGF受体结构特征 VEGF受体主要有两种：VEGF受体1（fms-like tyrosine kinase, Flt-1）和VEGF受体2（fetal liver kinase 1/kinase insert domain- containing receptor，Flk-1/KDR）表达基本局限于血管内皮细胞上，都为穿膜蛋白， 含有7个细胞外免疫球蛋白样功能区，一个跨膜区 和一个细胞内酪氨酸激酶功能区VEGF与其受体结合，通过VEGFRs二聚化，受体酪氨 酸激酶激活，促使底物磷酸化而产生化学趋化性、 促进细胞有丝分裂、肌动蛋白重组、促进内皮细胞 增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质的作用,22,VEGF与受体的结合力与受体是否是聚合形式密切相 关，聚合是强大亲和力产生的重要因素KDR是VEGF发挥主要功能的受体。VEGF与其受体结 合的能力依赖于细胞表面肝素或肝素样分子的存在KDR在与VEGF的亲和力、结合VEGF后所引起的受体 磷酸化作用、结合后所引起的细胞反应、与肝素的 结合力等许多方面作用都强于F1t-1,23,3.低氧对VEGF表达的影响及低氧诱导因子1（HIF-1） 的调控作用低氧主要通过活化VEGF基因的转录和增加VEGF mRNA稳定性，上调VEGF基因表达从而促进血管新生 低氧或缺血条件下，HIF-1能增加一些基因如红细 胞生成素(EPO)和VEGF基因的转录，增加氧输送能 力；葡萄糖转运体和糖酵解酶基因的转录；胰岛素 生长因子基因的转录，促进细胞的生存 HIF-1是由和亚单位组成的异源二聚体，其中 HIF-1是专一调节O2的HIF-1亚单位，决定了HIF-1 的活性,24,调控VEGF表达的信号通路,25,26,4. VEGF在细胞内信号传导通路,27,28,5. VEGF及其受体在血管新生中的作用和机制通过增强血管的渗透性,引起血浆蛋白(主要是纤维 蛋白原)的外渗,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管 网的建立提供了最佳的基质与受体结合,发挥其特异性的内皮细胞分裂原的活 性，诱导血管内皮细胞的增殖VEGF提高血浆活化因子和尿激酶类纤维蛋白原活化 因子表达，促进蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因 子的活化，具有促进血管构建作用,诱导血管形成,29,肿瘤细胞分泌的VEGF以旁分泌的形式作用于血管内 皮上的特异受体,诱导血管新生促进肿瘤的生长和 转移VEGF可能通过自分泌促进肿瘤细胞自身的生长：某 些肿瘤细胞自身确有一定量的VEGF表达；在Kaposi 肉瘤细胞中检测到高水平的flt-1和KDR；抑制VEGF 的表达能显著抑制瘤细胞的生长,30,三、血管新生抑制因子内源性血管生成抑制因子：蛋白质家族中的一些成员 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（serine proteinase inhibitor，serpin super family）中的PEDF， KBP，antithrombin，maspin等，以PEDF为例介绍 该类抑制剂的特点蛋白质大分子前体的水解产物 angiostatin，K5，endostatin，tumstatin等 以K5为例,31,PEDF（pigment epithelium-derived factor）1989年由Tombran-Tink从胎儿视网膜色素上皮细胞 培养液中分离出来，视网膜基质中以较高浓度存在 分子量 50KD，基因位于染色体17p13属于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族, 但不具备抗蛋 白酶活性 神经亲和保护作用；抑制血管增生,32,1.PEDF的抑制血管增生活性Dawson于1999年首次发现PEDF具有很强的抑制血管 增生的作用, 是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血 管形成的主要原因是血管生成最有效的天然抑制剂，比血管抑素、内 皮抑素活性更高 Gao等在视网膜新生血管大鼠模型中检测到视网膜 组织VEGF的含量较正常对照组升高5倍，PEDF的 含量下降了2倍，显示出在视网膜病理新生血管形 成中，血管抑制剂与血管刺激剂之间的平衡被打破,33,2. PEDF抗血管增生机制 PEDF促进血管内皮细胞凋亡体外实验,人血管内皮细胞培养液中凋亡阳性细胞 数随PEDF剂量的增加而增加体内实验, PEDF处理的高氧动物的视网膜凋亡内皮 细胞与未处理相比高8倍，对已存在的正常血管内 皮细胞无反应，说明PEDF仅对活化的血管内皮细胞 起作用,34,PEDF与胶原蛋白和肝素有高度亲和性，提示PEDF 可能作用于细胞粘附分子，即靶向细胞外基质来调 节其抑制血管内皮细胞增生的活性与其他血管因子的相互作用：PEDF下调VEGF表达； K5上调PEDF、下调VEGF表达机制尚有许多疑问：是否存在PEDF特异性受体； PEDF抑制内皮细胞的信号转导通路等,35,3. PEDF与肿瘤的关系PEDF抗肿瘤活性：诱导肿瘤细胞分化；抑制血管生 成；促进Schwann 细胞及神经节细胞产生更多的 PEDF，可能是神经母细胞瘤自然好转的缘故 前列腺癌组织中PEDF含量显著下降或缺如在黑色素瘤细胞系中首次检测到PEDF基因的缺失 PEDF基因和p53基因均位于染色体17p13.1, 肿瘤 发生与该区域关系密切,提示PEDF基因可能是抑癌 基因或是肿瘤相关基因,36,4. PEDF治疗血管增生性眼病Stellmach等腹腔内注射重组PEDF显著抑制了早产 性视网膜病（ROP）小鼠模型的视网膜血管增生Mori等在三种不同的眼血管增生模型中眼内输送 AdPEDF取得显著疗效：激光诱导的色素膜损伤所致 脉络膜新生血管(CNV)鼠模型；rhodopsin/VEGF转 基因鼠；ROP小鼠模型 AdPEDF眼内输送不仅抑制视网膜和脉络膜新生血 管形成，还可逆转已形成的新生血管FDA批准PEDF基因治疗进入期临床试验（2003年）,37,K5（plasminogen kringle 5） 1.K5结构特点：,38,39,人纤溶酶原是分子量为92 kD的糖蛋白，由5个通过 二硫键连接的联环结构域（kringle）构成，每个 联环结构域由80个氨基酸组成，含3个二硫键，形 成双环状构象纤溶酶原水解片段 K1、K2、K3、K5、K1-3、K1-4、 K2-3等均能抑制内皮细胞增生，K4不具有抗增殖活 性，却有明显抑制内皮细胞迁移的作用K1-4即血管抑制素，angiostatinK5是抑制内皮细胞增殖和迁移最有效的纤溶酶原片 断,40,K5是血纤溶酶原中与血管抑素相连的联环结构域， 由80个氨基酸残基组成，包含3个二硫键，分子量 为16kD 在结构上与其它4个联环区相似，具有较高的同源 性，其中与K1同源性最高，为 57.5。K5与K1结 构上的相似性可能与它们都有较强的抑制内皮细胞 增殖活性相关 完整的kringle结构是保证血管抑素抗内皮细胞增 殖所必需 kringle结构对K5活性的影响则有不同的看法,41,2. K5作用的分子机制kringle5抗血管增生的研究是建立在血管抑素基础 之上，二者可能有相似的抗血管增生的分子机制K5能特异性地作用于血管内皮细胞，使细胞周期停 滞，并能诱导内皮细胞凋亡K5选择性抑制内皮细胞迁移是其抗血管增生的重要 环节,42,K5能通过抑制HIF-1和p42/p44 MAPK的活性下调内 源性血管刺激因子VEGF的表达提高内源性血管增生抑制因子PEDF的表达，有利于 已打破的血管增生平衡恢复正常，K5对正负血管因 子的调节是其抗血管增生的主要机制 内皮细胞上是否存在K5的特异性受体目前看法不一： 有研究表明在培养内皮细胞上没有检测到K5特异性 受体，同时K5也不能阻止VEGF与VEGF受体的相互作 用 ；最近有报道认为人内皮细胞上电压依赖性阴 离子通道是K5结合的受体,43,K5和血管抑素抑制内皮细胞增殖机制可能通过细胞 外基质中某些多糖分子如整合素来发挥作用，因为 整合素是维持MAPK活性所必需的 K5抑制炎症细胞分泌细胞因子，如血管内皮 细胞生长因子、肿瘤坏死因子及白细胞介素-2等 K5降低血管通透性,44,研究工作积累,45,首次建立了固定氧浓度诱导的大鼠视网膜血管增生模型，该模型可用于所有以血管增生为治疗靶点的药物活性的筛选并进行定性定量分析。,46,高国全. FEBS Lett, 489,270-276,2001.,47,Gao et al. FEBS Lett, 489,270-276,2001.,48,高国全. FEBS Lett, 489,270-276,2001.,49,高国全. FEBS Lett, 489,270-276,2001.,50,首次发现大鼠对氧诱导的视网膜血管增生存在种系（strain）差异并阐明了这种差异形成的分子机制。,51,P12,P14,P18,SD,BN,高国全. Diabetes, 51(4), 1218-1225, 2002.,52,0,200,400,600,800,1000,1200,VEGF/PEDF Ratio (% of Control),Postnatal Days,P12 P14 P16,BN rats,SD rats,Strain Difference in VEGF:PEDF Ratio,高国全. Diabetes, 51(4), 1218-1225, 2002.,53,证明K5在体外实验中具有特异性抑制血管内皮细胞增生的作用并能在视网膜血管增生大鼠模型中预防和阻断新生血管的形成,54,55,56,发现K5具有上调PEDF并同时下调VEGF的作用，纠正了病理性低氧状态下内源性血管增生抑制因子和刺激因子之间的平衡失调。同时明确了K5下调VEGF的信号传导通路通过抑制MAP kinase的活性和HIF1的核转位,57,58,59,2.37,4.4,kb,18s RNA,0,20,40,60,80,10