2012-气相-液相-实验讲义

仪器分析（II）实验讲义 北京林业大学分析测试中心 2012/02 1 1 气相色谱实验 1.1 验证性实验 实验一 氢火焰检测器的调试与最小检测量的测定 【实验目的】 掌握 163 气相色谱仪的基本操作；理解氢火焰检测器的工作原理； 掌握氢火焰检测器灵敏度、检出限（敏感度） 、最小检测量的测定。 【基本原理】 氢火焰检测器，缩写为 FID(Flame Ionization Detector)灵敏度高、线性范围宽，响 应快，应用范围很广，FID 的结构和检测原理如下： 图 1 氢火焰检测器原理图 1、收集极 2、极化极 3、高电阻 4、空气入口 5、绝缘器 离子化室由不锈钢制成，载气、氢气混合物由底部进入，在喷嘴口遇到冷空气后 点燃形成火焰，作为离子化的能源，在与喷嘴同轴同水平处有一极化圈，上方是一圆 筒形收集极，在极化极与收集极上施加电压形成一个静电场，可使因火焰激发而产生 的离子（自由基）定向移动，当只有载气通过喷嘴时，因其中仍含有极微量的杂质被 电离，形成的极微弱的电流（10 -1110-12 A）叫做基流。 当有样品通过喷嘴时，有机物的分子因火焰激发引起自由基反应，形成离子，电 流急剧增大，可达 10-7A，记录下来就是信号峰，形成离子数量与单位时间进入火焰的 碳原子数成正比。 为了驱动记录仪，在离子化室中产生的信号必须经过放大，放大器分为二部分组 成。a、微弱的信号电流通过高阻时则在其两端产生电压降，这一电压信号就成为本级 的输出信号，b、直流放大（微电流放大器） ，前置级的输出作为本级的输入，经多级 放大后输出至记录仪，微电流放大器多为独立的单元，其中有放大器，稳压电源，调 节旋钮。 【公式计算】 1、 灵敏度 S：FID 的响应值与单位时间内进入检测器的组分质量呈线性关系，故定义 为： S= Ai：峰面积（cm 2） Ai=1.065HW1/2K 60C2RAi C1mi 2 K：衰减倍数 ，2，4，8，16 ，32，64，128。 H：峰高（cm） W1/2：半峰宽（ cm） R：仪器量程值（1，10，10 2 等） C2：记录仪灵敏度（mv/cm） （ 1、10） C1：记录纸速（cm/min） mi：进样量（g） 2、 检出限 D：检出限（敏感度）为检测器的最小检测量，对于质量型检测器而言， 它等于检测器正好产生三倍噪音信号时所需的单位时间（s）引入检测器的样品量 （g）： Dm = (g/s) 式中 Rn 为噪音(单位为 mv)，S 为灵敏度。 噪音：噪音就是零电位（又称基流）的波动， 反映在色谱图上就是基线的波动。 3、 最小检测量 Q0：是要使待测组分所产生的信号恰好能在色谱图上与噪音鉴别开来 时（3Rn） ，所需引入到色谱柱的组分的最小物质量或最小浓度。对于质量型检测 器： Q0m= Dm 由此看出，检出限与最小检测量是两个不同的概念。检出限只与检测器的性能有 关，而最小检测量不仅与检测器的性有关，还与色谱柱效和操作条件有关，如果峰形 窄，样品浓度越集中，最小检测量就越小。 【色谱条件】 色谱柱：玻璃填充柱，GDX-102，6080 目， 温度：柱温 140 检测器 200 进样口 140 载气：N 2 流量：30mL/min 燃气：H 2 1Kg/cm2 助燃气：空气 0.7 Kg/cm2 纸速：10mm/min 【实验步骤】 1、 气路检查：打开燃起（氢气） ，助燃气（空气） ，载气（氮气） ，检查是否有漏气， 尤其是氢气的检查，如果不漏气，暂时关闭氢气气路。 2、 打开日立 163 的主机电源，打开载气开关，接通气路。 3、 流速的测定：在检测器出口处连接一皂膜流量计，分别测定载气，燃气和助燃气 的柱体积流速，调节载气流量至 30mL/min，并调节氢气、空气流量，使 3Rn S C1 1.065W1/260 3 N2、H 2、AIR 流量比约为 1：1：10。 4、 开启控温单元，首先升汽化室、检测器的温度，待上述两处温度达到设定值后， 再升柱箱温度。 5、 以上各点温度稳定后，再开启放大器电源，放大器预热半小时后可进行初调。 6、 走灭火基线。放大器量程（range）选择开关置于 check 位置，放大器衰减(att)置于 1，调整基流补偿旋钮使检测器输出信号在200V 以内，走基线 510 分钟。 7、 点火。接通空气、氢气，调节好流量，点火。再将流量调节到适当值。 8、灵敏度的测定： 用 10l 的微量进样器进 1 l 正己烷的二氯甲烷溶液（正己烷含量为 100ppm） ，记录色谱图，根据情况改变衰减档，使色谱图大小适宜后再连续进三针， 所得色谱图要求重现性好，测量并记录正己烷峰下列参数：峰高（H） 、半峰宽 （W 1/2） 、记录纸速（ C1）记录仪灵敏度（C 2） 、量程值（R ） 、衰减值（K ） 。 9、噪音的测定： 在最佳条件下，选择较小的衰减值，观测并记录噪音水平 Rn，如在最灵敏状 态下基线仍无明显抖动，可以认为噪音等于（或小于）基线宽度。 10、关机：仪器使用完之后，设置降温方式，待进样器、检测器、柱箱温度都降低到 100 度以下，先关闭燃起（氢气） ，再关闭助燃起，载气，最后关闭主机电源。 【注意事项】 1、 不点火时严禁通氢气，通氢气后要及时点火，并保证火已点着。 2、 打开 FID 时必须先将极性选择开关置于零档，或每次关机前进行该操作。 【数据处理】 1、计算 FID 的灵敏度，以 mvsg-1 表示。 2、计算检测器的检出限。 3、 计算最小检测量。 【思考题】 1、常用的气相色谱仪检测器有那几种？ FID 的原理是什么？ 2、何为检测器的噪音、灵敏度、检出线、最小检测量？检出线和最小检测限之间有什 么区别？ 实验二 植物种子中脂肪酸含量的测定 【实验目的】 1、 练习脂肪酸的提取及其甲酯化衍生物的制备方法。 2、 了解和掌握 VARIAN CP-3800 的基本操作。 3、 了解毛细管色谱的特点及分流式进样器的原理。 4、 掌握 star60 气谱工作站的使用方法。 5、学会在色谱柱选定的情况下，如何改变柱温，使欲测定的物质得到适当分离。 【实验原理】 用气相色谱方法分析植物种子中脂肪酸时，由于植物种子中的脂肪酸以脂肪酸甘 油酯的形式存在，必须对其进行衍生化处理才能转化为气相色谱可以分析的状态。 脂肪酸甲酯化有如下的方法： 1、重氮甲烷法： 重氮甲烷不易保存，爆炸性强。 2、硫酸二甲酯法（甲醇溶液）：硫酸二甲酯的毒性太强。 3、盐酸甲醇或硫酸甲醇（酸催化法）：取 0.5mL 油脂样品于具塞试管中，加入 4 2.5硫酸甲醇 2mL，密封。70水浴加热 1 小时，正己烷提取分析。 4、碱催化：取 2 滴油脂样品于具塞试管中，加入 2mL 正己烷溶解油样，再加入 5 氢氧化钾甲醇溶液 0.5mL，震摇 5min，取上清液进样分析。 CH2O2CR+CH3OKHC2OH2+C3OCR 5、四甲基氢氧化铵法，是将种子中所含有的脂肪酸甘油酯皂化，再进行甲酯化。具体 方法如下： 皂化反应： CH2O2CR+(CH3)4NOCH3O2OH2+(CH3)4NOCR(3)4 甲酯化： (CH3)4NOCR+CH3I (CH3)4NI DMF+CH3OCR 甲酯化条件不同，GC 结果会有所差别。上述方法中，以碱催化法较简便，适合 于实验课程，本节实验课就采用此法分析菜籽油中得脂肪酸含量。此法供一般使用， 若需更精确定量，可对条件进行优化。 【仪器与试剂】 仪器 CP-3800 气相色谱仪（美国 VARIAN 公司） ； star60 气谱工作站（美国 VARIA 公司） ； 分流进样装置； 索式提取器； 恒温水浴； 试管、滴管等。 试剂 5氢氧化钾甲醇溶液 正己烷（A.R.） 色谱条件 色谱柱： CP-sil5 CB/15m0.25mm0.25； 检测器：FID（氢火焰检测） ； 柱温：柱温的选择对分离的效果有很大影响，为达最佳分离效果，此部分由同学自己 根据实验现象进行分析，对升温条件进行优化。 进样口：280； 检测器：300 载气：N 2； 流量：N 2（99.999%）：1-3mL/min，柱前压 20psi； H2：30 mL/min； Air：300 mL/min。 尾吹气：N 230 mL/min 【实验步骤】 （为节约时间，种子中游离脂肪酸的提取 1、2、3 部分为演示实验）： 1、取油松种子 4 克，在研钵中研细后装入滤纸筒中（或用滤纸包好） ，放入抽提瓶 5 中安装好索氏提取器 2、蒸馏瓶中加入石油醚至 2/3 处，加热水浴锅，将温度控制在 70，回流提取 40 分钟 3、提取完成后，将蒸馏瓶取下，在旋转蒸发仪上减压蒸去石油醚，即得松子油， 称出松子油的重量，并计算出油率。 4、脂肪酸甲酯衍生化：用碱催化法对脂肪酸进行甲酯化，静置分层，待上层完全 澄清后可取上层清液分析。 5、进样分析 用 10 微升微量进样器取 0.5 微升进样，采用初温 180，保持 5 分钟，每分钟 20，升至 280后恒定 5 分钟的升温条件，得到一张谱图，需对谱图进行分析， 对升温条件进行优化，再取样分析，直到得到较理想谱图。 【数据处理】 用色谱工作站数据系统对色谱信号（色谱峰）进行计算与处理，用面积归一化法 求出各脂肪酸的含量，所谓归一化法是以样品中各组分经校正过的峰面积或峰高之和 作为 1，以各组分经校正过的峰面积或峰高与全部峰面积或峰高之比值来表示样品中各 组分含量的定量方法。 1.2 设计型实验 实验三 气相色谱设计型实验 由于同学们的专业方向各不相同，本实验给同学们创造一次自己动手设计并完成 实验方案的机会。可根据自己专业方向的实际需要和实验室仪器设备的实际条件，选 择合适的实验内容。例如：植物组织中乙烯的取样与测定、天然水（或自来水）中有 机氯农药残留量的测定，果品中农药残留等等。 【实验要求】 1、所选择实验必须适合于气相色谱，若自己提供标样，要求达到色谱纯。样品要到 实验室处理。 2、由相同或相关专业的同学自由组成小组，每小组约 4-5 人，不宜过多。 3、实验由同学自行设计，可查阅文献。实验中心可提供相关材料。 4、如所在专业仪器分析应用很少，经实验指导老师同意，可选择中心推荐实验。 5、所有实验设计必须在做该实验的一周前交到实验指导老师处，由实验指导老师修 改认可后方能开始实验（样品可自带） 。 6、此实验还包括对气相色谱工作站的简单培训。 未尽事宜以授课教师讲述为准。 6 2 高效液相色谱实验 2.1 验证性实验 实验四 高效液相色谱基础实验（分 2 次实验完成） 【实验目的】 1、 了解高效液相色谱仪的工作原理和一般结构，并掌握它的使用方法； 2、 学会在色谱柱选定的情况下，如何改变操作条件，使欲测定的物质得到适当分离； 3、 了解不同的流动相流速及流动相比例对样品分离的影响。 【实验原理】 高效液相色谱仪是物理化学分离方法，其实质是利用不同物质在非互溶两相中具 有不同的分配系数（或吸附系数）而分离。即当流动相对固定相作单向流动时分析。 组分由于不断地被流动相冲洗而向前运动，被固定相保留能力小的组分移动速度快， 因而先被冲洗出色谱柱；保留能力大的组分移动速度慢，要用较长的时间才能被流动 相冲洗出柱子。这样由于各组分的保留能力不同，流出柱子的时间也就不同，由此得 到分离。当然，影响组分分离的因素很多，在液相色谱中，主要是通过选择和调节流 动相的种类、极性、流速、比例等来改善分离度。本实验通过改变流动相的流速和比 例来达到最佳分离效果的目的。 【实验内容】 第一部分：流动相流速对分离的影响及紫外检测器吸收波长的选择 流动相流速的快慢影响溶质在色谱柱中停留的时间。流速慢，溶质在色谱柱中停 留时间长，在固定相与流动相之间有足够时间达到平衡，有利于提高柱效；但是溶质 在流动相中纵向扩展也增加了，造成峰形展宽，柱效下降；此外，流速慢也使分析时 间延长。所以选择流速的标准是在样品组分间达到满意分离的前提下尽量提高流速， 以缩短分析时间。然而，在流动相组成、色谱柱以及整个色谱系统不变的情况下，增 加流速会使色谱柱前压增加，从而增加泵的负荷；柱前压增高还会造成泵的密封系统 受到损坏，容易发生色谱系统泄漏等问题。所以在实验中要作综合考虑。 在现代液相色谱中用得最多的是 C18 柱，它的填料是十八烷基（C 18）硅烷键合在 硅胶上的微粒，常用粒径为 5 微米和 10 微米两种。由于死时间 tM 是一个重要的色谱 参数，对于非极性的 C18 柱，通常选用极性并具有紫外吸收的对氨基苯磺酸（ ）来测定 tM，因为分子中的氨基（碱性）和磺酸基（酸性）能形成内盐（ ） ，而离子型的磺酸盐是强极性的，基本上不被非极性的固定相所保留。之所以多少有 些保留，是因为分子中存在苯环的缘故。 紫外检测器能检测对紫外光有吸收的样品，不吸收紫外光的样品（例如糖类等） 不能被检测，所以它是一种选择性检测器。紫外检测器的灵敏度与样品的性质有关， 一般对紫外光有吸收的样品在 254nm 的波长上都有紫外吸收，所以固定波长的紫外检 测器都使用 254nm 波长。但是 254nm 波长并不是所有样品的最佳吸收波长，例如苯甲 酸甲酯的最佳吸收波长为 230nm，因此用固定波长 254nm 的紫外检测器检出灵敏度不 SO3HH2N SO3H3N 7 高，而使用可变波长的检测器将波长调在 230nm，则苯甲酸甲酯的检测灵敏度要高得 多。 【色谱条件】 色谱柱：C 18 流动相：甲醇水 = 91 流速：0.5mL/min；1.0mL/min；1.5mL/min 检测器波长：254nm，230nm 样品：对氨基苯磺酸，苯，萘（标样与混合样品） ；甲苯，苯甲酸甲酯（标样与混合 样品） 【操作与记录】 操作：做三个流速，每个流速重复一次，各个流速之间要平衡几分钟。 记录： 流速 (mL/min) 0.5 1.0 1.5 柱前压 (psi) 样品 对 苯 萘 对 苯 萘 对 苯 萘 tR(min) Y1/2 k 2,1 n R 在流速 1mL/min 条件下进样甲苯和苯甲酸甲酯的混合物，在 254nm 和 230nm 条件下 分别记录色谱图，测量峰高值。 （注意：由于在 254nm 和 230nm 注射同一样品，两次注射 体积必须严格相同，否则会造成误差。 ） 【数据处理】 用下列公式计算：k=(t R - tM)/ tM ； 2,1= k2 / k1 n = 5.54(tR/ Y1/2)2 R = (tR2 - tR1)/( Y1/2(1) + Y1/2(2) 式中：k容量因子； tM 死时间； n柱效； R分离度； Y1/2半峰宽 将计算结果列表报告，并举一例列出计算公式与计算结果。 【注意事项】 半峰宽的测量方法应是在半峰宽处线条的外侧到另一边线条内侧的宽度。应使用测 量精度高的测量工具。适当加快走纸，增加峰宽，有利于减小测量误差。 k，n，R 都是无量纲数值，计算时要注意单位的一致。例如在计算柱效时， 如果 tR 是时间单位，Y 1/2 是长度单位，应将 Y1/2 的单位换算成时间单位后方可计 算。 第二部分 流动相的组成对分离的影响 在反相色谱系统中，溶质被固定相保留，同时又溶解在流动相中。在固定相一定时， 改变流动相的组成，可改变溶质的保留时间，从而影响分离度。 如何判断流动相组成改变对溶质保留时间的影响，可利用“相似相溶”经验规则。我 们要分析的物质一般为有机物，而有机物一般易溶于有机溶剂，难溶于水。在由水与有机 8 溶剂（如甲醇与水）组成的流动相中，增加甲醇的比例可降低溶质保留时间；相反减少甲 醇的比例可增加溶质保留时间（为什么？） 。 不同比例甲醇与水组成的流动相，其粘度不同，反映在柱前压也不同。从理论上讲， 用作紫外检测器的流动相在紫外部分应该无吸收，但由于杂质的影响总会有些吸收，这可 以用紫外检测器上的调零旋钮进行补偿。当从一种流动相换到另一种流动相时，由于紫外 吸收不同（为什么？） ，使零点改变，需重新调节零点。 更换流动相比例需平衡后才能进样，这可以从紫外检测器上吸收值不再改变（为什么？ ） ，泵上压力指示值不再改变（为什么？） ，最后基线稳定做出判断。 【色谱条件】 色谱柱：C 18 流动相：甲醇水 = 91，82 ，73 流速： 1.0mL/min； 检测器波长：254nm 样品：对氨基苯磺酸，苯，萘（混合样品） 【操作与记录】 操作：做三个流速，每个流速重复一次，各个流速之间要平衡几分钟。 记录： 甲醇水 9/1 8/2 7/3 柱前压(psi) 样品 对 苯 萘 对 苯 萘 对 苯 萘 tR(min) Y1/2 k 2,1 R 将计算结果列表报告，并举一例列出计算公式与计算结果。 【思考题】 1. 在具体实验操作过程中，应该注意的关键步骤是什么？ 2. 如何消除干扰因子？ 2.2 设计型实验 实验五 高效液相色谱设计型实验 由于同学们的专业方向各不相同，本实验将给同学们创造一次自己动手设计并完成设 计方案的机会。可根据自己专业方向的实际需要和实验室仪器设备的具体条件，选择合适 的实验内容。 【实验要求】 1、所选择实验必须适合于