rna提取相关试剂——depc和tris

DEPC 焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC 即 diethypyrocarbonate， DEPC 结构式 中文名为。分子式为 C6H10O5，分子量为 162.14。是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。 它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 DEPC 可以抑制植物细胞上的 NSCC，即 nonselective cation channel （非选择性阳离子通道） 。是 常用的 NSCC 抑制剂. DEPC 毒性 1 DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 是一种高效烷化剂。配置：加 0.1% DEPC 到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压 121， 20min， DEPC 即降解成二氧化碳 和水无毒。 2 DEPC 有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，DEPC 毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到 手上注意立即冲洗。 3 DEPC 是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和 乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。 DEPC 水泡过一次枪头后还能再用吗?是否每次都要重配？ 答：不能再用。每次处理耗材时都要用新配的。 DEPC 水用于配制电泳缓冲液和溶解 RNA. DEPC 在水中的半衰期 25 、磷酸缓冲液中其半衰期为 4 min（pH 6） 、9 min（ pH 7） 。Tris 缓冲液中 DEPC 的 降解会加快，25 时，半衰期为 1.25 min（pH 7.5） 、0.37 min（pH 8.2） 。 DEPC 加入到水中之后并不会立即溶解，而是形成小的球状液滴（类似于油滴） ，需要 彻底搅拌直至液滴消失才算混合均匀。此时的溶液才可以拿去高温除菌除 DEPC。一般灭菌 15min 即可将 DEPC 彻底除去。 （试验所用试剂也可用 DEPC 处理，加入 DEPC 至 0.1%浓度， 然后剧烈振荡 10 分钟，再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC，否则 DEPC 也能和 腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性） 配制 泡实验器具的 DEPC 水的配制：1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静 置 4 小时后备用。(DEPC 在高压时分解为二氧化碳和乙醇，所以，用来处理实验器具的 DEPC 水，就不能高压) 配 75%乙醇的 DEPC 水的配制：100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37 过 夜，送至高压。 （用来配制试剂的 DEPC 水是可以高压的。 ） 用途 DEPC 是一种有效的核酸酶抑制剂，它能够与很多酶的-NH ，-SH 或-OH 等基团发生反应， 从而破坏酶的活性位点。一般，常用浓度为 0.1%（1 L 水中加入 1 mL DEPC）的 DEPC 来作 为 RNA 酶的抑制剂。比如，进行 RNA 实验时，要用 DEPC 处理实验所用的水和各种溶液。 我们通常所说的 DEPC（处理）水是指用 DEPC 处理过并经高温高压消毒的 MiliQ 纯水。 DEPC（处理）水可以用于 RNA 沉淀的溶解，含有 RNA 的各种反应体系如反转录、 siRNA 的 退火等，以及其它各种要求无 RNase、DNase 和 proteinase 的反应体系。 使用注意事项 1、 DEPC 可能溶解掉某些塑料枪头，因此，量取 DEPC 时要用玻璃器具。 2、 DEPC 处理后的溶液要去除残余的 DEPC，一般 121灭菌 15 min 即可，也可以将其煮沸 15 min 以达到去除的效果。可能会残留些许气味，可以放心使用。 3、因为 DEPC 在 Tris、 HEPES 等缓冲液中极易分解，因此不能直接用 DEPC 来处理 Tris、HEPES 等缓冲液。这 种情况下，要先用 DEPC 处理水，然后再用 DEPC 处理过的水来配制缓冲液。 TRIS 性质描述：白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯、不溶于乙醚、四 氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性。 缓冲特性 Tris 为弱碱，在 25下，它的 pKa 为 8.1；根据缓冲理论，Tris 缓冲液的有效缓冲 范围在 pH7.0 到 9.2 之间。Tris 碱的水溶液 pH 在 10.5 左右，一般加入盐酸以调节 pH 值至 所需值，即可获得该 pH 值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris 的 pKa 的影响。 衍生缓冲液 由于 Tris 缓冲液为弱碱性溶液，DNA 在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其 溶解性。人们常常在 Tris 盐酸缓冲液中加入 EDTA 制成“TE 缓冲液” ，TE 缓冲液被用于 DNA 的稳定和储存。如果将调节 pH 值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE 缓冲液” （Tris/Acetate/EDTA） ，而换成硼酸则获得“TBE 缓冲液” （ Tris/Borate/EDTA） 。这两种缓冲 液通常用于核酸电泳实验中。 制备 Tris 可以由两步反应生成：先由硝基甲烷生成中间体三羟甲基硝基甲烷（(HOCH2) 3CNO2） ，然后再由该中间体还原得到 Tris。 应用 Tris 常用作生物缓冲液，常配成 pH 值为 6.8，7.4 ，8.0，8.8。其 pH 值随温度变化 很大。一般来说，温度每升高一度，PH 值下降 0.03。 1M Tris-HCl 6.8 和 1.5M Tris-HCl 8.8 是 SDS-PAGE 最常用的试剂。 而由 Tris 配成的 TAE，TBE 等是 DNA 电泳最常用的试剂， TE（pH8.0）主要用于溶解 DNA。 （TE 为 Tris 加 EDTA 合称。 ） Tris 缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris 被用于不同 pH 条件下的蛋白质晶体生长。 Tris 缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤 层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。 Tris 也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。此外， Tris 还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris 也被用作滴定标准物。 TRIzol 主要成分 TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质 解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中 还加入了 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、 -巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase（RNA 酶） 。 0.1%的 8羟基喹啉可以抑制 RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰 酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失， 导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 - 巯基乙醇的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。 使用方法 用匀浆器将组织磨碎，加入 TRIzol 处理组织。5 分钟后加入氯仿，以每分钟 12000 转 离心 5 分钟，样品即分成水样层、中间层和有机层。 RNA 存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀 RNA 来还原。 在除去水样层后，有机层中的 DNA 和蛋白质也能相继以沉淀的方式还原：乙醇能使 中间层的 DNA 沉淀析出，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。 每 100ml TRIzol 可以抽提 100 个六孔板中的样品或 100 个 50-80mg 的组织样品。无论 样品是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(约五百万个) 及大量的组织(1g)和细胞(超过一千万个)均有较好的分离效果。 每一百万细胞用 TRIzol 抽提可得 5-15 微克 RNA，每毫克组织用 TRIzol 抽提可得 1-10 微 克 RNA（产量因细胞和组织不同而异） 。 TRIzol 操作上的简便性允许其同时处理多个样品，所有的操作可以在一小时内完成。 TRIzol 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白质的污染，故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂 交、poly(A)+ 选择、体外翻译、 RNA 酶保护分析和单分子克隆（PCR） 。 如果是用于 PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的 DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总 RNA。 TRIzol 试剂能促进不同种属、不同分子量大小的多种 RNA 的析出。例如，从大鼠肝 脏抽提的 RNA 经过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于 7kb 和 15kb 之间的 不连续的高分子量条带（mRNA 和 hnRNA 成分） ，两条优势核糖体 RNA 条带位于5 kb (28S) 和2 kb (18S)，低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3kb 之间 (tRNA, 5S)。当抽提的 RNA 用 TE 稀释 时，其 A260/A280 比值1.8。抽提小 RNA 时宜-70沉淀过夜。 TRIzol 对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。 1.样品的制备 当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和 植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在 28C 的条件下以 12,000g 的 离心力离心 10 分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以 及高分子量 DNA，而上层的超浮游物含有 RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪 漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加 入氯仿并继续进行下述的分离步骤。 2. 分离阶段 将匀浆样品在 1530C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。每 1 ml TRIZOL 加 0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒并将其在 30C 下孵育 23 分钟。在 28C 下以不超过 12,000g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟。离心后混合物 分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于 水样层当中。水样层的容量大约为所加 TRIZOL 容量的 60%。 3. RNA 的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离 DNA 和蛋白，有机层 同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA。最初均化时的每 1 ml TRIZOL 对 应 0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在 1530C 条件下孵育 10 分钟并在 28C 下以不超过 12,000g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。RNA 沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。 4 .RNA 的洗脱 移去上层悬液。用 75%的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，每 1 ml 的 TRIZOL 至少加 1 ml 的 75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在 28C 下以不超过 7,500g 的离心力高速 冷冻离心 5 分钟。 5. RNA 的再溶解 在操作的最后，简单干燥 RNA 沉淀（空气干燥或真空干燥 510 分 钟）不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是，不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大 地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 A260/280 比值 1.6。用移液管尖分几次移取 无 RNA 酶的水或 0.5% SDS 溶液来溶解 RNA，并在 5560C 下孵育 10 分钟（当 RNA 以后 要用于酶切反应时，避免使用 SDS。 ）RNA 还能被 100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存 在70C。 RNA 抽提注意事项 1.从少量的组织(1 10 mg)或细胞(102 104)中分离 RNA 样品：往组织或细胞中加入 800 l TRIZOL。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉淀 RNA 之前，加入 510g 无 RNA 酶的脂质体(CatNo 10814)作为水样层的载