工艺流程-基因工程药物之干扰素的制备流程课件(ppt 37页)

基因工程药物 -干扰素的制备 1 什么是干扰素 u 概念 (interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时 ，免疫细胞通过抗病毒应答 反应而产生的一组结构类似 、功能接近的生物调节蛋白 。 u 根据分子结构和抗原性的差 异分为 、 、 、 等 4个类 型。 1.1天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFN、 IFN、 IFN 、 IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节 (较弱） 其中 IFN- 为多基因产物，有 23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素 （ IFN) 来源：活化的 T细胞和 NK细胞产生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强 Tc细胞和 NK细胞的杀伤活性 抑制 TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（ HuIFN），小鼠干扰素（ MuIFN）。 v 不同来源的干 扰素 1.2 重组干扰素的临床应用 v 广谱抗病毒活性（ rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎 。 v 直接抗肿瘤活性（ rhuIFN） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。 v 免疫调节活性 治疗慢性肉芽肿瘤（ rhuIFN） v 多发性硬化症 rhuIFN 2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺 干扰素生产工艺路线 上市产品：重组人干扰素 rhuIFN 1986， rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990， rhuIFN-1b； 1993， rhuIFN-1b； 2001 2002： PEG化 IFN， PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化， N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程 。 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺 : v 目的基因的分离 克隆载体 目的基因与克隆 载体的体外重组 重组体导入大肠杆菌 K12 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因 表达载体 重组质粒 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测 工 程菌 基因工程菌的制备 一、目的基因的分离与扩增 v 1. 破碎细胞，用 Trizol法提取总的 RNA v 2. 将生产干扰素的人白细胞的 mRNA分级分离然后进行凝胶 电泳切取目的基因片段 v 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总 mRNA逆转录成 cDNA v 4. 以 cDNA为模板、干扰素引物为引物， PCR，得到完全的干 扰素基因的 PCR产物 v 5.人工加尾形成 “ 粘性末端 ” 二、构建重组质粒 v 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因 的 PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接 EcoR I BamH I EcoR I BamH I 2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选 三、重组体引入宿主细胞 将 cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。 四、受体菌的筛选 由于质粒重组时有 3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 五、分析保存 对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。 干扰素的发酵工艺过程 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装 v 1菌种培养 取 70 下保存的甘油管菌种（工作种 子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度 30 ， pH7.0， 250 r/min活化培养 182 小时后，进行吸光值测定 和发酵液杂菌检查。 v 2种子罐培养 将已活化的菌种接入装有 30L培养基的 种子罐中，接种量 10%，培养温度 30 ， pH7.0，级联调节通 气量和搅拌转速，控制溶解氧为 30%，培养 3 4小时，转入 发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和 LB培养基划线 检查，控制杂菌 v 3.发酵罐培养 将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接 种量 10%，培养温度 30 ， pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧 30%，培养 4小时。然后控制培养温度 20 ， pH6.0，溶解氧 60%，继续培养 5 6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当 OD值达 9.01.0 后，用 5 冷却水快速降温至 15 以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至 10 以下。 v 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测 。菌体于 20 冰柜中保存时，不得超过 12个月。每保存 3 个月，检查一次活性。 3. 干扰素的分离纯化工艺过程 3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程 3.1 干扰素分离工艺过程 v 菌体裂解 v 预处理 v 初级分离 (1)菌体裂解 v 裂解缓冲液：纯化水配制， 2 10 （ pH7.5） v 使用保护剂： EDTA， PMSF。 v 破碎菌体： 2厘米以下的碎块 v 搅拌：加裂解缓冲液， 2 10 ， 2hr v 冻融 : 细胞完全破裂，释放干扰素。 (2)预处理 -沉淀 v 加絮凝剂聚乙烯亚胺 : 2 10 ，搅拌 45min，对菌体碎片进行絮凝。 v 加凝聚剂醋酸钙溶液 : 2 10 ,搅拌 15min，对菌体碎片、 DNA等进行 沉淀。 (3)离心 v 连续流离心机： 2 10 ， 16000 r/min v 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 v 杂质沉淀： 121 、 30min 蒸汽灭菌 ,焚烧处理。 （ 4）初级分离 v 盐析 : 硫酸铵， 2 10 ，搅匀 ,静置过夜。 v 离心：连续流离心机， 16000 r/min v 保存：收集沉淀，粗干扰素， 4 保存。 3. 2、干扰素纯化工艺过程 v 溶解粗干扰素 v 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 v 无菌过滤分装 (1) 溶解粗干扰素 v 配制纯化缓冲液： 超纯水， pH7.5磷酸缓冲液， 0.45 m滤器和 10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2 10 。 v 检查 : 缓冲液的 pH值和电导值。 v 溶解： 2 10 ，匀浆，完全溶解。 (2) 沉淀与疏水层析 v 等电点沉淀（ 1）：磷酸调节至 pH5.0，沉淀杂蛋白 ，离心收集上清液。 v 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集： 0.01M磷酸缓冲液（ pH8.0） v 等电点沉淀（ 2）：磷酸调节 pH4.5，调节电 导值 40 ms/cm， 2 10 ，静置过夜 v 超滤： 1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 v 透析除盐：调整溶液 pH 8.0，电导值， 10 ku 超滤膜， 0.005 M缓冲液。 (3)无菌过滤分装 0.22 m滤膜过滤干扰素溶液 v 分装 v 20 以下的冰箱中保存。 (4)检测项目 v 干扰素鉴别试验 v 干扰素效价测定 v 蛋白质含量，纯度测定，分子量 v 宿主残余蛋白、残余 DNA v 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱， N端序列 v 其他：热原，内毒素，残留抗生素 半成品检定 v （ 1） 效价测定 用细胞病变抑制法，以 Wish细胞、 VSV病毒为基本检测 系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。 v （ 2） 蛋白质含量测定 v 福林 -酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋 白为标准。 v （ 3） 比活性 v 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。 v （ 4） 纯度 v 电泳纯度用非还原型 SDS-PAGE法，银染显色应为单一 区带，经扫描仪测定纯度应在 95%以上。 v （ 5）相对分子量测定 v 还原型 SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相 对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对 分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比 较，误差不得高于 10%。 v （ 6）残余外源性 DNA含量测定 v 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外 源性 DNA应低于 100pg。 v （ 7）残余血清 IgG含量测定 v 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项 检定。 v （ 8）残余抗生素活性测定 v 半成品中不应有抗生素活性存在。 v （ 9） 紫外光谱扫描 v 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在 2802 纳 米。 v （ 10） 肽图测定 v 用 CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批 与批之间应一致。 v （ 11） 等电点测定 等电聚焦电泳。 v （ 12） 除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。 成品检定 v （ 1） 物理性状 v 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得 含有肉眼可见不溶物。 v （ 2） 鉴别试验 v 应用 ELISA或中和试验检定。 v （ 3） 水分测定 v 用卡氏法，应低于 3%。 v （ 4） 无菌试验 v 同半成品。 v （ 5） 热原质试验 v 同半成品检定。 v v （ 6） 干扰素效价测定 v 同半成品检定，效价不应低于标示量。 v （ 7） 安全试验 v 取体重为 350-400克豚鼠 3只，每只腹侧皮下注射 量为成人每千克体重临床使用最大量的 3倍，观察 7天，若豚 鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重 18-20克小鼠 5只，每只尾静脉注射剂量按人 每千克体重临床使用最大量的 3倍，观察 7天，若动物全部存 活，说明成品合格。 4