油脂类食品中脂肪酸单氯丙醇单酯和双酯的分离测定

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 油脂类食品中脂肪酸单氯丙醇单酯 和双酯的分离测定 摘要：建立了食品中脂肪酸单氯 丙醇单酯与双酯含量的测定方法。称取 0.1 g 的油脂样品，加入内标后，转入氨 基固相萃取柱，先以 6.0 mL 正己烷洗 脱脂肪酸单氯丙醇双酯（MCPD 双酯） ， 再以 6.0 mL 正己烷-乙酸乙酯混合溶剂 洗脱脂肪酸单氯丙醇单酯（MCPD 单酯） ，分别收集洗脱液并浓缩至近干，残余 物经甲醇钠水解和苯基硼酸（PBA）衍 生后，供气相色谱/质谱（GCMS）分析。 MCPD 单酯、 MCPD 双酯的检出限在 83142 g/kg（均以 MCPD 计）之间， 线性范围为 25500 g/L（R20.9990） 。 以花生油和婴幼儿奶粉脂肪提取物为基 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 质，在 2501000 g/kg 范围内进行 3 种浓度水平的加标回收实验，MCPD 单 酯与双酯的回收率在 86.5%104.0%之 间，相对标准偏差（RSD）为 2.4% 13.2%（n=6） 。此外，本方法成 功应用于市售食用植物油和婴幼儿奶粉 中 MCPD 单、双酯的污染调查。 中国论文网 /8/view-12767063.htm 关键词：脂肪酸； 3 氯 1，2 丙 二醇单酯； 3 氯 1，2 丙二醇双酯； 2 氯 1，3 丙二醇单酯； 2 氯 1，3 丙二醇 双酯； 食用植物油； 奶粉； 气相色 谱质谱法； 固相萃取法 1 引言 氯丙醇与脂肪酸酯化形成的脂肪 酸氯丙醇酯（氯丙酯）是近年来国际上 新出现的食品安全问题，尤其是脂肪酸 3 氯 1，2 丙二醇酯（简称 3MCPD 酯） 的污染最为突出。氯丙醇是公认的食品 加工中形成的污染物，3 氯 1，2 丙二醇 （3MCPD）具有肾脏毒性、生殖毒性、 免疫抑制作用和潜在致癌性而被广泛关 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 注1， 2。早在 1980 年就发现植物蛋白 在酸水解中会形成 3MCPD 酯3，4 ， 随后在奶粉5、山羊奶6、食用油7 以及油炸食品8中也检出该成分。氯丙 酯尤其在食用油和奶粉等脂肪含量较高 的食品中污染水平较高，食物中氯丙酯 的含量是氯丙醇的 5396 倍913， 因此氯丙酯问题引起了欧盟等食品安全 机构的极大关注。目前， 氯丙酯的毒 性仍不清楚，对其健康风险的担心主要 是因为氯丙酯的水解产物氯丙醇的毒性 作用14 17。3MCPD 酯在肠道水解后 将增加人体 3MCPD 的暴露水平， 3MCPD 摄入量是其暂定每日最大耐受 量（TDI） （2 g/kg bw）的 5100 倍18， 19。由于 3MCPD 具有 12 个 羟基，因此 3MCPD 酯具有 3MCPD 单 酯和双酯两种形式，结构上的差异可能 导致毒理学作用的差异。实验表明， 3MCPD 双酯会致大鼠精子减少（生殖 毒性） ，3MCPD 单酯不仅具有生殖毒性， 还可能造成大鼠肾小管坏死（肾脏毒性） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 16。在模拟肠道的脂肪酶水解试验中 发现，3MCPD 单酯水解生成 3MCPD 的速率远超过 3MCPD 双酯 20，21 。 因此，有必要对 3MCPD 单/双酯进行分 离和分别检测，获得食品中 3MCPD 单 酯与双酯含量的数据，以更准确地评估 3MCPD 酯的健康风险。 国际上测定食品（油脂）中 3MCPD 酯总量的研究较多22 ，但对 3MCPD 单/双酯含量分别检测的研究极 少。据报道采用氨丙基 （Aminopropyl）23 或硅胶24 固相萃 取法，以正己烷、乙醚、二氯甲烷、石 油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱，将 3MCPD 单酯与双酯分离，进一步水解、 净化、衍生后，用 GCMS 分别检测。 但该法所用溶剂种类多、比例复杂、体 积多达 850 mL、操作较为繁琐，且未 证实方法是否适合各类油脂中不同脂肪 酸组成的氯丙醇单酯、双酯。超临界流 体色谱三重四级杆串联质谱法也可用于 测定 3MCPD 单酯/ 双酯25 ， 该法测定 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 步骤虽简单，但对仪器要求较高，且容 易污染。本研究采用氨基固相萃取法， 利用正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱， 并采用碱水解苯基硼酸（PBA）衍生 GCMS 法测定 26；方法除了可测定 3MCPD 单酯 /双酯外，还可能适用于 2 氯 1，3 丙二醇（2MCPD）单酯/双酯的 测定。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 3800 型气相色谱仪和 Saturn 2200 离子阱型质谱仪（美国 Varian 公 司） ；NEVAPTM 111 型氮吹仪（美国 Organomation Associates 公司） ； Microfuge 型高速离心机（美国 Beckman 公司） ；6 mL 聚丙烯固相萃取 柱柱筒（Angela 公司） 。玻璃器皿在 220 下烘烤 3 h 后使用。 2.4 标准曲线的建立 准确移取适量标准及内标工作液， 以正己烷稀释成浓度分别为 25， 50， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 100， 200 和 500 g/L 的 MCPD 单酯、 MCPD 双酯标准系列，内标浓度均为 100 g/L，再按文献 21方法水解、净 化、衍生处理，供 GCMS 分析。 2.5 样品中氯丙酯含量的测定 上样： 称取 0.1 g 食用油或油脂 食品的脂肪于 1.5 mL 塑料离心管中， 准确加入混合内标工作液 50 L， 涡旋 混匀后超声 5 min，转入固相萃取柱 （500 mg/6 mL，经 4.0 mL 正己烷活化） ，并以 0.2 mL 正己烷洗涤离心管两次， 将洗涤液一并转入固相萃取柱中。 洗脱：先以 6 mL 正己烷洗脱 MCPD 双酯；再用正己烷/乙酸乙酯 （73， V/V）洗脱 MCPD 单酯，分 别收集洗脱液，并将洗脱液置于氮气流 下缓缓浓缩至近干。 分别于上述分离得到的样品中， 超声混匀，再按文献 26方法水解、净 化、衍生处理，得到 1.0 mL 待测溶液， 供 GCMS 分析，以同位素内标法定量。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 3 结果与讨论 3.1MCPD 衍生物的鉴定以及定 量离子的确定 3.3 洗脱分离溶剂的比例 分别以 10 mL 不同比例的正己烷 乙酸乙酯（91， 82， 73， V/V）和正己烷作为洗脱剂，每种条件 重复 3 次。对于 MCPD 双酯， 4 种溶剂 皆能将其洗脱下来，但以 10 mL 正己烷 的洗脱效果最优，回收率为 83.1% 103.0%； 对于 MCPD 单酯， 除 10 mL 正己烷外，其余 3 种比例的溶 剂均能将其洗脱下来，并以正己烷乙酸 乙酯（73， V/V）洗脱效果最好，回 收率在 87.2%97.8% 之间。这可能由 于 MCPD 单酯与双酯结构上有差异， 导致两者极性不同，含有一个羟基的 MCPD 单酯极性略强于 MCPD 双酯。 因此，采用正己烷作为 MCPD 双酯的 洗脱溶剂，正己烷乙酸乙酯（73， V/V）作为 MCPD 单酯的洗脱溶剂。 3.4 洗脱分离溶剂的体积 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 为进一步确定所需的洗脱剂体积， 分别以 10 mL 正己烷、正己烷 /乙酸乙 酯（73， V/V）洗脱 MCPD 双酯与 MCPD 单酯，每 2 mL 为一阶段收集洗 脱液。结果表明，无论是 MCPD 单酯 还是 MCPD 双酯，当洗脱溶剂体积为 4.0 mL 时，其回收率较为理想 （94.6% 99.3%） ；增至 6.0 mL 时，结 果与 4.0 mL 相差不大，说明 4.0 mL 溶 剂足以洗脱大部分的 MCPD 单酯/双酯。 但考虑到实验条件可能存在的微小变化， 如填料的松紧或者洗脱流速的差异等， 甚至某些样品 MCPD 单/ 双酯含量异常 高，因此洗脱溶剂体积均选择 6.0 mL。 3.5 不同类型脂肪酸 MCPD 单/双 酯的分离验证 考虑到不同类型脂肪酸的碳数和 单双键数量、空间结构等不同，由此可 能导致其洗脱特性不同，需进一步验证。 以不同种类脂肪酸构成的 MCPD 单酯、 MCPD 双酯标准液（十二碳的饱和月桂 酸、十六碳的饱和棕榈酸、十八碳的不 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 饱和亚麻酸、十八碳的饱和硬脂酸）进 行实验。结果表明，6.0 mL 正己烷可把 上述各类脂肪酸的 MCPD 双酯洗脱下 来，回收率为 92.3%97.4%，但无法 洗脱 MCPD 单酯，见图 2；但以 6.0 mL 正己烷酸乙酯（73， V/V）混合液可 将 MCPD 单酯洗脱下来，回收率为 93.7% 99.4%，见图 2a；由此可见， 优化的方法适用于各类脂肪酸 MCPD 单酯与双酯的分离。 3.6 检出限和定量限 在花生油基质中加标，获得 3MCPD 单、双酯和 2MCPD 双酯的检 出限（LOD ，S/N=3）分别为 83， 125 和 100 g/kg，定量限 （LOQ ，S/N=10）分别为 278， 417 和 333 g/kg。在婴幼儿奶粉脂肪提取 物基质中，3MCPD 单、双酯以及 2MCPD 双酯的检出限略高，分别为 95.1， 142 和 122 g/kg， 脂肪定量限 分别为 316， 473 和 406 g/kg，这说 明即使在基质较为复杂的婴幼儿奶粉脂 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 肪提取物中，方法的检出限和定量限也 满足分析要求。 3.7 线性范围 3MCPD 棕榈酸单酯与双酯以及 2MCPD 二硬脂酸酯含量分别以 3MCPD 和 2MCPD 计算。以 3MCPD， 2MCPD 与各自内标峰面积比值 y 和各自的质量 x（ng）计算线性回归方程。结果表明， 在 25500 ng 范围内线性关系良好，相 关系数 R2 均大于 0.9990。 3.8 准确度和精密度 3.9 实际样品分析 利用本方法调查了 12 个品种的 72 份市售食用植物油样品和 7 个品牌 31 份婴幼儿配方奶粉中 MCPD 单/双酯 的含量，同时按文献 26 方法测定脂 肪酸 MCPD 酯总量。结果表明，脂肪 中以 MCPD 双酯含量为主体， MCPD 单酯含量占 MCPD 酯总量的 5.0% 45.0%。此外，利用本方法测定 的 MCPD 单酯、双酯含量之和占用文 献21方法测定 MCPD 酯总量的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 71.9% 98.2%，验证了本方法的可靠性。 本方法操作较为简便、灵敏度较 高、结合内标标准曲线法定量，结果准 确可靠， 适用于检测食用植物油和婴 幼儿奶粉中 MCPD 单酯、双酯含量的 检测方法。 References 1JECFA， Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives， Meeting （ 67th： 2006： Rome， Italy） Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants： Blumhorst， 2011 #42 Sixtyseventh report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives， WHO Technical Report Series， 2007， 940： 45-48 2Lynch B S， Bryant D W， Hook G J， Earle R N， Munro I C. 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