传染病检测技术在血液筛查中应用的现状

传染病检测技术在血液筛查中应用的现状 北京市红十字血液中心 邱艳 一、 血液筛查的发展历史 （PPT1）从血液筛查的发展历史可以看到，在二十世纪 60 年代，输血传染病高达 25%。1970 年发现了乙肝表面抗原，然后对其进行检测，输血后的感染率降到 10%。1980 年检测艾滋病病毒后，输血感染率继续下降，随后检查抗核抗体、丙肝等，输血感染率降 到很低。 （PPT2）显示的是输血传染病的检测方法，1970 年采用颗粒凝集法，1980 年采用 ELISA 酶联免疫法，1990 年采用化学发光法，目前多采用核酸法。 目前，输血感染率的残余风险逐渐降低，2001 年达到百万分之几的概率。 二、HIV 感染诊断 （一） HIV 感染诊断实验的种类 1. 抗体检测实验 间接酶联法测抗体 , 直接 ( 双抗原夹心 ) 法测抗体 , 快速诊断法检测抗体抗体确 认试剂 , 其他抗体检测试剂。 2. 抗原检测实验：主要是检测 P24 抗原。 3. 抗原和抗体联合检测实验：与 ELISA 抗体检测兼容性良好，成本低。 4. 核酸检测实验：核酸定性和定量检测实验。 （二）HIV 检测的标记物 PPT6 显示的是 HIV 的不同标志物。HIV 感染后的 10 天以内是窗口期，不能检测出病 毒。约 5 天后会出现 P24 抗原，即病毒核酸 RNA 复制，随后机体的免疫系统对其进行识别， 会产生 IgG、IgM。四十天后，会出现 IgG 抗体。这些标志物中，只有 IgG 抗体是稳定的。 （三） HIV 抗体检测方法 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA） ELISA 最早用去污剂裂解 HIV 或感染细胞液提取物作抗原，IFA 用感染细胞涂片作抗 原进行抗体检测。 2.抗体确证实验 3.其他类抗体检测试验 （四）抗 -HIV EIA 检测试剂的发展 第一代是 HIV-1 病毒裂解产物，检测类型是 IgG 类抗体。第二代是 HIV-1+2 人工合成 肽，检测类型是 IgG 类抗体。第三代是 HIV-1+2 基因重组，利用双抗原加锌法，检测 IgG、IgM 抗体，把窗口期缩短到三周。第四代是 HIV-1+2 基因重组，利用双抗原加锌法， 检测 IgG、IgM 抗体与抗原，把窗口期缩短到两周。现在又加入核酸，可以缩短到一周之内， 越来越安全。 （五）确证试验 初筛 HIV 阳性的，利用确证试验来确认。 确证试剂： 蛋白印迹法（Western Blot，WB）类确证试剂：抗原多为全病毒裂解抗原，用聚丙烯 酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳将 HIV 蛋白按其分子大小进行分离，将凝胶中的不同 HIV 蛋白 条带电泳转移至硝酸纤维薄膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，检 测针对不同结构蛋白抗体。这类试剂的抗原条带全，包括 control 带，膜区抗原 gp160、gp120 和 gp41，核心抗原 p55、p24 和 p17，聚合酶抗原 p66、p51、p39 和 p31，还 有 HIV-2 型特异性抗原，特异性较高。 喷膜类确证试剂：主要采用基因工程表达的抗原，其抗原条带没有全病毒裂解抗原全， 但包含有主要的抗原条带，如 LiaTek HIV-III 确证试剂包含 HIV-1 型 env 区 gp120 和 gp41,gag 区 p24 和 p17，pol 区 p31, HIV-2 型 env 区的 gp105 和 gp36。 （六）其它 HIV 抗体类检测 1.胶体金类快速检测 近几年开发了以胶体金或硒为标记物、以硝酸纤维素膜为载体、以层析形式进行固相 免疫测定的技术，利用该技术制备了 HIV 抗体快速诊断试剂，该试剂稳定，可以在室温条 件下保存一年或更长。操作简单而快速，数分钟即可得出结论，不需仪器设备，尤其适于 单份测定等。但其灵敏度偏低 。 2.唾液 HIV 抗体检测 3.乳胶颗粒检测 4.尿液 HIV 抗体检测 （七） HIV 核酸检测 1.HIV 核酸定性检测：主要用于窗口期的早期诊断以及献血者的筛选。 2.HIV 核酸定量检测 3. HIV 核酸诊断试剂的种类 有雅培的、贝尔的、罗氏的试剂。 三、 抗 -HCV 检测 抗 HCV 检测主要用于献血源筛查以及实验室诊断。 （一） HCV 抗体筛查中的抗原决定簇 PPT18 是 HCV 的结构基因。有核心区、包膜区，包膜区有一区、二区，非结构区 NS2、3、4、5，然后这些区都会刺激机体产生抗体。第一代抗体只是针对细胞膜区来设计 的。第二代抗体加大了 NS3 的检测。第三代抗体加入了 NS3、NS4、NS5 及核心区的检测。 第四代增加了抗原的检测。 （二） RIBA HCV 3.0 1.用于筛查实验阳性（RR）样品的 HCV 抗体确认。 是为与高灵敏度的 ORTHO HCV 3.0 ELISA 试剂相匹配而研发的确认试剂。 2.可辅助生化检测结果用于肝炎诊断。 3.独特的 IgG（I/II）及 hSOD 内部质控设计。 4.用于检测的固相化抗原：重组表达蛋白：c33c、NS5；合成肽抗原：c100p（5-1- 1p）、c22p。 四、最新一代乙肝病毒表面抗原诊断试剂 （一）最新一代诊断试剂的检测标准 1. 检测到突变株，突变株可产生于：自然发生、疫苗接种、使用抗 -HBS 免疫球蛋 白。 2. 野生型向突变株的转变趋势： 200 年内野生型 HBV 消失。 3. 最常见的突变类型，氨基酸残基 124-147 之间、 145 位甘氨酸突变为精氨酸。 （二） HBsAg 补充 / 确认实验 - 中和实验 目的：解决血液筛查实验如 ELISA 中的非特异性问题； 策略：对双孔复检阳性的样品进行确认实验； 方法：HBsAg（HBsAg 中和实验）、抗-HCV（重组免疫印迹实验，RIBA）、抗- HIV（WB，RIBA）。 （三） HBsAg 中和实验 采用特异性 anti-HBs 抗体，对发生反应的标本中的 HBsAg 进行中和，如果是非特 异性的反应，特异性 anti-HBs 抗体将不会中和引起非特异性反应的干扰物质。 五、试剂的评估与质量控制 （一） 试剂的评估与质量控制的主要内容 主要原材料的质量控制：包括试剂所用抗原、抗体、核酸引物以及核酸探针等；生产 过程的质控；临床前评估：分析灵敏度、分析特异性、精确性、可重复性、准确性、定量 范围、回收实验等；国家生物制品研究总院鉴定 : 注册前检验、批批检等；临床研究：灵 敏度、特异性；市场监控；常规使用中的室内室间质量控制。 （二） 国家生物制品研究总院鉴定 国家生物制品研究总院要进行注册前检验和批批检。国家有很多标准品。比如 HIV 抗 体参考品，用于酶免试剂的检定，快速试剂、确证试剂，检测唾液、尿液试剂，P24 抗原 参考品。每一类产品国家都有标准。 例如第三代 HIV 抗体国家参考品： 研制时间： 2001-2003.4 参考品组成： 阴性参考品： 20 份 阳性参考品： 20 份 最低检出限参考品： 5 份 精密度参考品： 1 份 质量标准： 阴性参考品符合率： 18 / 20 阳性参考品符合率： 20 / 20( 其中 P11 、 P12 2.0 且 P12 P11) 最低检出限参考品符合率： 3 / 5( 至少检出阳性反应 3 份且基质血清阴性反应 ) 精密度 (n=16) 15% （三）试剂的临床研究与评估 包括灵敏度、特异性和产品性能。灵敏度是指试剂检出患病的能力。特异性是在正常 人群里边你能甄别出这些人是正常的试剂的能力。 临床研究的意义以及目的： 临床前样 品虽有代表性，但数量毕竟有限并不能完全代表临床情况。通过临床试验对临床前制定的 各项指标进行修正，可以发现或预测在实际应用中遇到的问题，在说明书中提醒用户注意。 诊断试剂临床评价的指标有：灵敏度、特异性、样品分布、阳性预期值、阴性预期值。 （四）试剂的注册后质量控制 市场监控、常规使用中的室内室间质量控制。 六、输血传染病的职业暴露 （一） 职业暴露的定义 病人的血液或具有传播病原体的体液，包括精液、阴道分泌物、脑脊液、滑膜、胸膜、 腹膜、心包液、羊水及含有病原体的实验室样本，经医务人员和实验室工作人员破损的皮 肤而感染。由于针刺伤或利器割伤；或经皲裂、擦伤或患有皮炎的皮肤和黏膜导致感染。 （二） HIV 传播途径及效率 性传播，男男之间为 1%，男性传给女性效率要低，女性传给男性效率更低了，女女之 间现在不明确。经血传播，共用注射器单次暴露的传染概率为 0.67%，职业暴露是 0.3%， 输血单次暴露的传染概率大于 90%，母婴传播是 30%-50%。 七、 新输血传染病的挑战和应对