超强2006江西大肠会在大肠腺癌中的表达_陈壬寅课件

EphA2在大肠腺癌中的表 达 第一部分 大肠腺癌中EphA2表达及其与 临床病理学因素、DNA倍体、 细胞周期关系的研究 EphA2基因的介绍 nEphA2是Lindberg于1990年用简并引物从人角化细胞 cDNA文库中筛选得到的一个Eph（Erythropoitin- produceing hepato-cellular,Eph) 亚家族成员 。 n人EphA2基因定位于1p36.1,有17个外显子。 n Eph受体家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体 (receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 nEph家族受体激酶和他们EFN配体介导的细胞信号 传 导参与神经系统的基本发生过程、神经系统的信号传 递，在细胞的分化、发育、增殖，组织和器官的形成 、血管生成、细胞与细胞之间的粘附及肿瘤的发生 和肿瘤的新生血管的形成等过程中发挥重要的和必 不可少的作用。 EphA2与肿瘤的关系 nEphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系，如 ：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，肾 细胞癌等，目前认为EphA2参与肿瘤的发生和发展 ，是功能强大的癌基因。 nEphA2的高表达能诱导非转化乳腺和前列腺上皮细 胞在体内、外的恶性转化，并促进其侵袭转移 。 n应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验，下调EphA2 蛋白表达的同时，也抑制了肿瘤细胞的生长，进而 降低肿瘤的恶性程度 。 154例大肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河 南省肿瘤医院2001年1月2004年12月手术切除标本的存档蜡块 (其中66例为手术切 除新鲜标本和蜡块和88例存档蜡块) 1份置4%多聚甲醛中固定存放另2份置-82中存放 石蜡包 埋、切 片、 HE 染色 石蜡包埋 、切片， 进行免疫 组化 提取总 mRNA 、 进行RT - PCR 实 验 标 本 FCM检 侧DNA 倍体、细 胞周期 细胞增 殖率 临床病理资料 154例（88例存档石蜡包埋标本和66例手 术切除新鲜大肠腺癌标本）大肠腺癌患者 ，术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。 其中男性 78例，女性 76例，年龄在 23-85岁 之间，平均年龄为 49.7岁。 66例新鲜手术切除标本均为大肠腺癌： 分化程度:高分化腺癌30例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌13例。 浸润深度:粘膜层10例，粘膜下层0例，肌层14 例，浆膜层37例，外周组织5例。 转移：有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移 者50例；有血道转移者1例，无血道转移者 65例；无种植性转移。 88例存档蜡块全部为腺癌: 分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低 分化29例和未分化20例； 浸润深度：粘膜层62例，粘膜下层1例，肌层17例、 浆膜层5例，外周组织3例； 转移：有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者74例 ；有血道转移者11例，无血道转移者77例；有种 植性转移者10例，无种植性转移者78例 。 技 术 路 线 免疫组化（SP法)FCMRT-PCR技术 检测154例大肠腺癌组织 和相应正常食管组织中 EphA2蛋白表达 检测66例大肠腺癌手术切 除新鲜组织和相应正常大 肠粘膜手术切除新鲜组织 中DNA倍体、细胞周期、 细胞增殖率 探讨EphA2表达与大肠腺癌病理临床因素、DNA倍体、细胞周期的关系 检测66例大肠腺癌手术切 除新鲜组织和相应正常大肠 粘膜手术切除新鲜组织中 EphA2mRNA表达 一. 免疫组化 v 步骤 （略） v 对照组设计：以已知EphA2阳性食管鳞癌和正常食管 粘膜腺体组织切片作为阳性对照，用正常兔IgG代替一抗 作为阴性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。 v 免疫组化结果判定及定量分析：EPhA2免疫组化阳性 表达位于细胞胞浆，呈棕黄色。定量分析采用高清晰图 像处理系统，随机取10个高倍视野进行图像分析，对免 疫组化切片检测EphA2阳性细胞数，依据阳性细胞所占肿 瘤细胞面积的百分比和染色强度判断结果。 实 验 方 法 二 .组织中总RNA的提取及RT-PCR v步骤 （略） v RNA浓度的测定 （略） v对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。 v（2）内参对照：用-actin作为内参引物，与EphA2 和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下出现 一条330bp的荧光带 v结果判定 v阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝 胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带 。 实 验 方 法 取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g 剪碎100、300目尼龙网上搓 收集细胞液，800prm/min离心2min 70%乙醇(4)中固定1h LPR染液,避光冷藏(4)5min Stain 1ml避光30min. 上机检测 FCM实验步骤： FCM对照组设计和诊断标准： n 设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量 n和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 nDNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 n量的细胞群表现为直方图中独立的峰,即每个峰表示一定DNA含量或倍体 n的细胞亚群。在正常对照组中,第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 n组中，第1个峰代表双倍体(G0/G1 ,2C)细胞亚群,第3个峰则代表四倍体 n(G2/M，4C)细胞亚群，两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 n个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。 n 诊断标准:根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 n单倍体细胞平均百分数相比较,在其两个标准差之内为正常,否则为异常。 FCM计算标准： nDNA指数(DI)计算公式：DI=样品细胞G1峰道数均值正 常组织细胞G1峰道数均值。 nDNA含量分析:以DNA指数(DI)表示细胞DNA相对含量， 根据DI值判断DNA倍体。0.9DI 1. 1 为DNA二倍体;DI 1. 1 为异倍体。 n细胞周期分布的计算：运用DNA细胞分析软件，计算出各 时相的分布百分比，以S期细胞比率(SPF)和增殖指数（PI ）表示细胞的增殖活性。 nSPF( %) = S ( G0/ G1 + S + G2M) 100 % nPI=(S+G2)（G1+S+G2）100% 统计学处理 所有数据均经SPSS 12.0软件进行统计分析。计数 资料计算阳性率，计量资料用采用XS表示；阳 性率之间的比较采用2检验（chi-square）及Fisher 确定概率计算法；两组均数的比较用t检验(t-test) ；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）和 Spearman等级相关分析；两变量之间的关系分析 采用相关分析；多变量之间的关系分析采用秩和 Chi-sguare 检验；行程列表Chi-sguare检验。显著性 水准=0.05。 EphA2mRNA及蛋白表达与大肠腺癌 的关系：免疫组化结果 n免疫组化检测结果： nEphA2蛋白定位于癌细胞、 粘膜上皮细胞及癌组织血 管内皮胞浆内，呈棕黄色 。 n阴性对照均无阳性显示。 大肠腺大肠腺癌组织癌组织及正常粘膜组织中及正常粘膜组织中 EphA2EphA2蛋白的表达蛋白的表达 正常粘膜 116(75.3) 6(3.9) 26（16.9） 6（3.9） 1.3690.663 腺 癌 12（7.8）32（20.8）48（22.7） 62（40.3）4.7890.542 组别 EphA2蛋白表达（例数%）a 阳性细胞面积（XS)b 0级 I级 II级 III级 一一. . 大肠腺癌组织和正常粘膜组大肠腺癌组织和正常粘膜组 织中织中EphA2EphA2蛋白表达蛋白表达 注：注：a:a: 2 2 =70.5706, P70 30 5 (16.7) 8 (26.8) 9(30.0) 8(26.8) 0.577 性别b 男 78 7(9.0) 21 (26.8) 26(33.3) 2 4(30.9) 女 76 5 (6.6) 11(14.5) 22 (28.9) 38 (50.0) 0.074 a: 2=7.580; b:2=6.928 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P 肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798 大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228 c:2=9.8600; d：2=7.5625 三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B) 详细部位不清 EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因 素的关系(C) 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P 肿瘤体积 (直径cm) 9.1 7 2(28.6) 2(28.6) 2(28.6) 1(14.2) 0.533 2=10.723 EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系(D) 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P 分化程度a 高分化 51 3(5.0) 7(13.7) 18(35.3) 23(45.1) 中分化 41 1(2.4) 9 (22.0) 18(43.9) 13(2.4) 低分化 42 7 (16.7) 13(31.0) 10(23.8) 12(28.6) 未分化 20 1(5.0) 3（15.0） 2(10.0) 14(70.0) 0.007a 浸润深度b 粘膜层（T0） 72 6(8.3) 21(29.2) 24(33.3) 21(29.1) 粘膜下层(T1) 1 0(0.0) 1(100) 0(0.0) 0(0.0) 肌层(T2) 31 2(6.5) 6 (19.4) 13(41.7) 10(32.3) 浆膜层(T3) 42 4(9.5) 2(4.8) 7 (16.7) 29(69.0) 外周组织(T4) 8 0(0.0) 2(25.0) 4(50.0) 2(25.0) 0.004b A:2=22.730 ； b:2=29.225 EphA2蛋白表达与大肠腺癌的关系 (E) 淋巴道转移c 有 30 4 (13.3) 7(23.3) 12(40.0) 7(23.3) 无 124 8(6.5) 25(20.2) 36(29.0) 55(44.3) 0.1207c 血道转移d 有 12 0 (0.0) 1(8.3) 7(58.3) 4(33.3) 无 142 12(8.5) 31(21.8) 41(28.9) 58(40.8) 0.1348d 种植性转移e 有 0 0 (0.0) 0(0.0) 7(70.0) 3(30.0) 无 144 12(8.3) 32(22.2) 41(28.5) 59(41.0) 0.0783e 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P c:2=5.8205; d：2=5.565；e:2=6.8070 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200 EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆, 强度I级 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200 EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆, 强度II级 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200 EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细 胞的胞浆,强度III级 EphA2在大肠腺癌组织中的表达 SP法200 EphA2蛋白阳性染色定位在肿瘤区 域和血管内皮细胞 EphA2基因RT-PCR结果 EphA2基因RT-PCR结果： - 经RT-PCR扩增，目的条 带为586bp。与EphA2引 物同管扩增的-actin 内参引物为 330bp的荧 光条带。以去离子水代 替提取的总RNA的阴性 对照无任何荧光条带显 示。 大肠腺癌癌组织和正常粘膜中 EphA2mRNA表达 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 600bp B -actin 200bp 一.EphA2mRNA表达与大肠腺癌临 床病理学因素的关系 临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P 正常组织 66 21 45 0.70750.3576 癌组织 66 22 44 0.26a 0.85010.4610 0.54k 性别 男 33 13 20 0.36210.2314 女 33 9 24 0.296b 0.20280.2996 0.888l 年龄 30 1 0 1 0.35400.446 30-60 40 19 21 0.79210.2364 60 25 3 22 0.006c 0.36910.4328 0.001m EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理 学因素的关系(A) A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322 k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学 因素的关系(B) 临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P 分化程度 高分化 30 6 24 0.51620.6321 中分化 23 11 12 0.74210.3261 低分化 13 5 8 0.089d 0.50260.6741 0.499n 浸润深度 粘膜层 5 2 3 0.50260.6459 粘膜下层 5 2 3 0.36540.6598 肌层 14 4 10 0.86210.3654 浆膜层 38 11 27 0.30110.3224 外周组织 5 2 3 0.038e 0.71490.1190 0.000o d: 2=4.837; e: 2=10.120; n:F=0.474; o: F=48465; EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学 因素的关系(C) 临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P 转移 淋巴道转移 有 16 6 10 0.34620.1791 无 50 16 34 0.685f 0.38960.1779 0.161p 血道转移 有 1 1 0 0.24960.7961 无 65 21 44 0.154g 0.24170.8192 0.953q f: 2=0.165; g: 2=2.031; p: F=2.119; q: F=0.004; EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系(D) 临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P 部位 升结肠 9 4 5 0.19850.751 横结肠 2 1 1 0.24170.8192 降结肠 0 0 0 0.00000.0000 乙状结肠 16 6 10 0.24130.7231 直 肠 39 11 28 0.720h 0.19510.7950 0.795r 肿瘤大体类型 隆起型 38 17 21 0.24130.7231 溃疡型 22 4 18 0.24960.7211 浸润型 3 0 3 0.23150.2339 管周型 3 1 2 0.112i 0.23510.2996 0.366s 肿瘤体积(直径cm) 5 32 14 18 0.43620.665 5 34 8 26 0.082j 0.44610.674 0.060t h: 2=1.337; i: 2=7.081; j: 2=3.033; r: F=0.342; s: F=1.076 t:F=9.286 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 700bp B -actin 300bp M:标准分子量(100bp DNA ladder); A: EphA2 cDNA，片段大小586bp; B：内参照-actin, 片段大小330bp; 1: 阳性对照：2：: 癌浸润浆膜层;3： 癌浸润肌层; 4： 癌浸润粘膜下层;5： 对应的正常粘膜6: 阴性对照 EphA2在大肠腺癌组织中的RT-PCR结果 二.大肠腺癌中EphA2蛋白表达与 EphA2 mRNA表达的关系 大肠腺癌中EphA2蛋白表达与EphA2 mRNA 表达的关系 EphA2 mRNA EphA2 protein + 合计 + 17 23 40 5 21 26 合计 22 44 66 2=0.25 ，P=0.6171 不同级别EphA2蛋白表达的大肠腺 癌中的EphA2 mRNA表达 EphA2蛋白表达分级 例数 EphA2/-actin (XS) 0 5 0.310.22 I 3 1.120.30 II 5 1.600.25 III 9 1.390.31 注: 0:I:II:III F=17.811 P0.05 EphA2与DNA倍体、细胞周期和 细胞增殖率关系 FCM检测结果 一.大肠腺癌和正常组织中DNA含 量和DNA倍体 一.大肠腺癌和正常组织中DNA含 量和DNA倍体的比较 病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 正常 组织 66 1.00.1 66 0 癌组织 66 1.670.19 0.005 7 59 0.005 a : F=6.086;b：F=3.697; 二.大肠腺癌DNA含量和DNA倍体 与病理临床因素的关系 二.大肠腺癌DNA含量和DNA倍体与 病理临床因素的关系(A) 病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 年龄 30 1 1.100.17 1 0 30-60 40 1.260.21 5 35 60 25 1.110.15 0.215c 1 24 0.086m 分化程度 高分化 30 1.160.21 3 27 中分化 23 1.230.16 2 21 低分化 13 1.320.17 0.489d 2 11 0.455n c: F=1.701;d：F=0.770; m:F=2.644;n: F=0.890 大肠腺癌DNA含量和DNA倍体与病 理临床因素的关系（B) 病理临 例数 DI (XS) DNA倍体 床因素 P 二倍体 异倍体 P 性别 男 33 1.320.12 4 29 女 33 1.280.11 0.056 3 30 0.056 F=6.277;F=3.697 大肠腺癌DNA含量和DNA倍体与 病理临床因素的关系(C) 病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 浸润深度 粘膜层 5 1.270.23 1 4 粘膜下层 5 1.310.21 0 5 肌层 14 1.300.22 2 12 浆膜层 38 1.490.29 2 36 外周组织 5 1.370.15 0.11e 2 3 0.550o 淋巴道转移 有 16 1.310.20 2 16 无 50 1.430.16 0.224f 5 45 0.224p 血道转移 有 1 1.430.33 0 1 无 65 1.390.20 0.938g 7 58 0.967q e：F=4.016; f：F=1.684; g：F=0.006; o: F=0.363;p: F=1.684;q: F=0.086 大肠腺癌DNA含量和DNA倍体与 病理临床因素的关系（D) 病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 部位 升结肠 9 1.480.23 1 8 横结肠 2 1.390.31 1 1 降结肠 0 1.100.20 0 0 乙状结肠 16 1.460.26 2 14 直 肠 39 1.430.21 0.765h 3 36 0.909r 肿瘤大体类型 隆起型 38 1.430.21 3 35 溃疡型 22 1.360.20 2 20 浸润型 3 1.390.31 1 2 管周型 3 1.660.23 0.432i 1 2 0.371s 肿瘤体积(直径cm) 5 32 1.490.31 4 28 5 34 1.660.23 0.086 j 3 31 0.761t h：F=0.274; i：F=0.913; j:F=2.644; r: F=0.097; s:F=0.816;t:F=0.094 正常大肠粘膜组织的细胞周期 分布 和DNA倍体 大肠腺癌的细胞周期分布， 出现异倍体峰 三.大肠腺癌组织中EphA2蛋白和 EphA2mRNA表达与DNA倍体和DI的关 系 大肠腺癌组织中EphA2蛋白和EphA2mRNA 表达与DNA倍体和DI的关系 EphA2 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 蛋白表达 阳性 40 1.760.26 4 36 阴性 26 1.690.32 0.903a 3 23 0.745c mRNA表达 阳性 22 1.790.31 4 18 阴性 44 1.870.39 0.273b 3 41 0.518d a: F=0.016;b: F=1.243;c: F=0.413;d: F=0.426 四.大肠腺癌DNA倍体与SPF、PI 的关系 大肠腺癌DNA倍体与SPF、PI的关系 DNA倍体 例数 SPF( XS) P PI(XS) P 二倍体 7 11.062.52 20.732.52 异倍体 59 13.142.04 0.042a 23.32.66 0.032b 注：a: 2 =1.2; b: 2 =1.1 EphA2蛋白的表达结果分析 一. EphA2在正常大肠粘膜上皮中的表 达结果分析 1.EphA2 在正常大肠粘膜上皮低表达，阳性率仅为 24.67%（38/154），且阳性细胞III级染色仅占 3.9%，阳性细胞大部分定位于大肠粘膜隐窝上皮 基底部的胞浆,少量阳性细胞亦可见于表面粘膜腺 体，提示可能EphA2作用于增殖期上皮细胞，也 可能参与细胞分化。 2.本研究发现的EphA2在正常大肠粘膜上皮和血管内 皮细胞的表达和分布模式提示，EphA2可能参与 了正常大肠粘膜上皮的增殖过程。 二. EphA2在大肠腺癌中的表达结果分析 (1) EphA2广泛高表达于许多人类肿瘤，无论 从肿瘤细胞还是肿瘤组织的检测都高表达， 包括：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌、 食管癌、肺癌和宫颈癌。本研究发现，相比 正常大肠粘膜上皮，EphA2在腺癌组织中高 表达，统计学分析差异有明显显著性 (P0.001)，表明EphA2高表达可能与大肠腺粘 膜上皮的癌变相关。 EphA2高表达与大肠腺癌的生长方式、癌的 组织学分级、癌细胞浸润深度相关，表明 EphA2的高表达导致癌细胞恶性程度和侵袭性 增加，使其更易发生浸润。 EphA2高表达与淋巴道转移、血道转移、种 植性转移无关，表明EphA2的高表达与大肠腺 癌癌细胞的转移潜能无关。 二. EphA2在大肠腺癌中的表达结果分析 (2) 三. EphA2蛋白在大肠腺癌组织中血管内 皮细胞的阳性表达结果分析 本研究发现在大肠腺癌组织中， EphA2阳性表达也见于血管内皮细胞， 通过大肠腺癌细胞和血管内皮细胞 EphA2阳性表达细胞计数对比，两者呈 正相关，表明EphA2参与肿瘤组织中的 血管形成，从而促进肿瘤的生长、发展 。 EphA2mRNA 的结果分析 一、EphA2mRNA表达与大肠腺癌临 床病理学因素关系的结果分析 应用