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第七章 生物分子的分离纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物大分子（蛋白质、核酸、糖 复合物等） 生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类 分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组 成生命的基本单位。 包括 小分子（如脂类、激素、维生素等） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 5）能人工合成与改造。 生物分子是生物所特有的有机化合物， 具有如下主要特征： 1）结构复杂有序、具有特殊的层次； 2）行使专一的功能； 3）代谢是其存在的条件； 4）生物分子体系具有自我复制的能力； Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 一、生物大分子的制备 生物大分子指的是作为生物体内主要 活性成分的各种分子量达到上万或更 多的有机分子。常见的生物大分子包 括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方 法可通用于各种生物大分子的分离制备； （2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确 估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中 各种组份的综合影响 生物大分子的制备有以下主要特点： Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物大分子制备的一 般步骤： 确定制备的目的和要求 文献调研和预备性实验 建立相应的可靠的分析测定方法 材料的破碎和预处理 分离纯化方案的选择和探索 产物纯度的鉴定 产物的浓缩，干燥和保存。 科研、开发或 发现新的物质 制备的关 键 要求达到一维电泳一 条带，二维电泳一个 点，或HPLC和毛细 管电泳都是一个峰 最困难 的过程 掌握目的产 物 的理化性质 特异性强 准确度高 灵敏度高 使用快捷方便 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样 ，主要是利用它们之间理化性质的差异。 根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 破碎方法应用 机械法研磨法细菌、酵母 匀浆法机体软组织 捣碎法动物韧性组织 化学法酶解法细菌、酵母 去垢剂组织、细胞 有机溶剂细菌、酵母 物理法反复冻融法细胞 超声波法细胞悬液 低渗裂解法红细胞 冷热交替法细菌、病毒 常用破碎方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 影响提取效果的因素 （1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物大分子的分离纯化 （1）盐析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics （2）有机溶剂沉淀法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics (3) 透析 (dialysis) 利用透析袋 把大分子蛋 白质与小分 子化合物分 开的方法。 含蛋白溶 液透析袋 透析液 磁子 电磁搅拌器 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 二、核酸的分离纯化 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者 ，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定 了两者的最适分离与纯化条件的不同 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分离纯化的原则 一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清 除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中， 核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以 及和其他生物大分子结合的方式。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 对于核酸的纯化应达到以下三点要求： 1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对 酶有抑制作用的有机溶剂； 2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 保持核酸的完整性 在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。 1）温度不要过高(04)；(高温破坏氢键 ) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破 坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力. Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 核酸制备的技 术路线 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 核酸的浓缩、沉淀与洗 涤 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢 失，样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能 满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓 缩。 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， 优点： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 核酸的鉴定与保 存 （一）核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光 光度法与荧光光度法进行。 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的 碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线， 其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖 及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭 （ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后 ，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧 光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量 呈正比。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法 皆可用于核酸制品的纯度鉴定。 紫外分光光度法：该法主要通过A260与 A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA 的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯 。 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸 电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子 较RNA大得多，电泳迁移率低。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 完整性鉴定 琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳 结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈 拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三 条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提 示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带 ，则说明存在DNA 的污染。 其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴 定RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics (1) 对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存数年 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或 双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧 钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数 年。 （二）核酸的 保存 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。 真核基因组DNA的分离纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1、酚抽提法 (SDS法） 本法最初于1976年由Stafford及其同事提出， 通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定 纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 裂解液中： EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞 膜稳定性 SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并 使其变性沉淀，同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防 止DNA变性 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 2、 甲酰胺解 聚法 该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用于 制备大片段DNA 1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法 相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰 胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然 后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和有 机溶剂。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3、玻棒缠绕 法 用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代 ，现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经 改进而来。 本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带 钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转 移至pH8.0的TE缓冲液中。 该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb， 适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法 、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法 q 根据细胞裂解方式的不同有： Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 吸附材料结合法： q 根据核酸分离纯化方式的不同有： 硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目 的物，从而达到分离目的。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法： 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 基因组DNA片段 的纯化 纯化的原则与要求 纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀 等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化 与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则： 一是提高片段的回收率； 二要清除回收的DNA样品中的污染。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1.回收率 为提高DNA片段的回收率，可 通过提高DNA样品的上样量和选择适宜 的方法与材料而实现。 2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂 抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。 柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段 从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE ）-纤维素（cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 从聚丙烯酰胺凝胶回收 DNA片段 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎 与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切 出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲 液浸泡，使DNA洗脱出来。 该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依 分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等 。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转 染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操 作简单，是小片段DNA回收的较好方法。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 质粒DNA的提取与纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等 这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的 释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1、碱裂 解法 在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用强 阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与 NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生 变性，释放出质粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 q 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC 质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱 性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质 粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。 该法操作简单、重复性好且成本低，制备的 质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求， 是使用最广泛的方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 q 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 2、SDS裂解法 SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中 ，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细 菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等 渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗 涤质粒DNA 由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（ 15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞 碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3、煮沸裂解法 该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备 煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌 酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁 后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配 对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但 CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后， CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去 除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的 质粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 质粒DNA的纯化 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB 存在的条件下，各种不同密度的物质经离 心平衡后得以分开。 2、聚乙二醇沉淀法 （一种分级沉淀法） 3、柱层析法 （树脂） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它 还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的 环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其 生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性 剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（ denaturant）后，RNase的活性又可恢复。 因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染 及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的 关键 真核细胞RNA的分离纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的 最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。 选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈 的胍类变性剂）。 蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS 、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用 RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大 地防止内源性RNase对RNA的降解。 此外，在变性液中加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇 （DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有 利于RNase的变性、水解与灭活。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以 含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的- 巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0 的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最 后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA 。 。 本法具有简便、快速、经济、高效及提取的 RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个 标本 酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分离总RNA Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics mRNA的分离纯化 与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不 同，真核生物的mRNA在细胞中含量少，种类 多且分子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白 的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长 短不同的poly（A）尾巴。 依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则， 通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂 糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA 制品中分离纯化mRNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1、oligo（dT）-纤维素柱层析法 2、oligo（dT）-纤维素柱离心法 3、oligo（dT）-纤维素液相结合离心法 4、磁性球珠分离法 该法联合利用了oligo（dT）与poly（A） 的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素 （streptavidin）的结合特异性以及磁性分 离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏 及快捷的分离。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 + 总RNA中的poly(A) +RNA分子 退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 链亲和素标记的磁珠 + Streptavidin- 磁 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁 生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离 5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁 洗涤与洗脱 水相(含纯化的 mRNA) 固相 生物素标记的oligo(dT) 磁铁 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁 图 3-2 磁珠分离法纯化poly(A) +RNA的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 5、其它方法 Poly(U)-凝胶层析法: 利用 Poly(U)与 Poly(A)的互补配对原理 Poly(U)-滤纸法: 将总RNA加到共价交联有 Poly(U)的滤纸上,经洗涤后加热洗脱 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics q 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics q 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1.DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 2.DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离 子 1.重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前） 2.重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次） DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原 因 对 策 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1.材料不新鲜或反复冻 融 2.未很好抑制内源核酸 酶的活性 3.提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题二：DNA降解。 对 策 原 因 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 2.动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题三：DNA提取量少。 对 策 原 因 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 三、蛋白质的分离与纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组 成、结构及生物学功能、新蛋白质的发 现和疾病分子诊断的基础；分子克隆中 ，下游的处理和分析鉴定，基因工程产 品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯 度（purity）或比活（specific activity ），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含 量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫 克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法 去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶 蛋白的产量达到最高值。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的一般技术路线 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活 性蛋白质的变性； 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要 求。纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如 纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均 高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上 希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工 业生产和分子诊断中则正相反。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的条 件 蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分 子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极 不稳定，因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需 要特定的条件。应注意各种因素对靶蛋白的影响 。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 缓冲液 盐、金属离子和螯合剂. 3. 还原剂 4. 去垢剂 5. 增溶剂 6. 蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor） 7. 蛋白质的环境因素 表面效应的影响 温度的影响 储存 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质 量大小及形状、电离性质和生物学功能的差 异而进行的。分离纯化的方法可分类如下： 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分 配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶 等； 以分子大小及形状差异为依据的方法：差 速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤 层析等； Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 以电离性质差异为依据的方法：电泳、 离子交换层析等； 以生物学功能专一性为依据的方法：亲 和层析。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋 白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化 膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电 排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适 用于在等电点pH稳定的蛋白质。 有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持 低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶 解度降低而沉淀。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质 水化膜 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒 酸碱 酸碱 酸碱 脱水作用脱水作用脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 超过滤超过滤除小分子杂质，分离、浓除小分子杂质，分离、浓 缩蛋白质缩蛋白质 加 压 蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板 超滤液 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 凝胶过滤层析(gel filtration) 凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛 ，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一 种方法。 凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中， 大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空 隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内 部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后 流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样， 因分子大小的不同得以彼此分开。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 离子交换层析的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 电 泳 蛋白质在高于或低于其 pI的溶液中为带电的颗 粒，在电场中能向正极 或负极移动。这种通过 蛋白质在电场中泳动而 达到分离各种蛋白质的 技术, 称为电泳 (elctrophoresis) 。 电泳(elctrophoresis) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 几种重要的蛋白 质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：常用于蛋白质分 子量的测定。 每一个蛋白质分子都因为结 合了许多的SDS而带有大量 的负电荷，而蛋白质分子原 有的电荷则可以忽略。由于 所有的蛋白质颗粒都带有大 量的负电荷，而且它们的电 荷密度也大体相同，因此， Eq值接近一个常数。所以该 法主要利用了蛋白质分子量 大小不同而分离蛋白质。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 等电聚焦电泳（isoelectric focusing ，IEF） 通过蛋白质等电 点的差异而分离 蛋白质的电泳方 法。pH梯度以两 性电解质 ampholyte（脂 肪族多胺和多羧 同系物）在外电 场作用下自然形 成。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 方法原理优点缺点 凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高、不会引起 变性 凝胶介质昂贵、处理量有 限 离子交换层析各组份与离子交换剂 亲和力不同 分辨力高、处理量较 大 需酸碱处理树脂、操作耗 时 电泳法等电点、分子量、电 荷的差异 分辨力很高、可连续 制备 仪器试剂昂贵 盐析法破坏水化膜和中和表 面电荷 操作简便、成本低、 重复性好、对蛋白有 保护作用 分辨率差、纯化倍数低、 沉淀中混杂盐分 选择性沉淀等电点、热变性、酸 碱变性等沉淀作用 选择性较强、方法简 便、种类较多 应用范围较窄 有机溶剂沉淀脱水作用和降低介电 常数 操作简便、分辨较强对蛋白质或酶有变性作用 亲和层析蛋白质与配体之间特 殊的亲和力 分辨力很高局限性大 高速与超速离心沉降系数或密度差异操作方便、容量大设备昂贵 制备HPLC凝胶过滤、离子交换 、反向色谱等 分辩力很高、步骤少 ， 仪器昂贵 常用的蛋白质分离纯化方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在，每种类型的细胞都含有成千上 万种不同的蛋白质，蛋白质的分离纯化往 往要采取多种方法联合使用，并通过预实 验进行条件优化，逐步地制备高纯度或高 比活的靶蛋白，实现蛋白质分离纯化的目 标 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质的纯度（purity）一般指是否含有其 它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS 等小分子在内，一定条件下的相对均一性。 目前常用的鉴定纯度的方法有：有聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、毛细管电 泳（CE）、等电聚焦电泳（IFE）及高效液 相色谱（HPL