微生物的遗传变异与育种.ppt

微生物的遗传变异与育种 第八章 本章内容 ： 基因突变与诱变育种 基因重组 菌种的衰退、复壮及保藏 第一节 基因突变与诱变育种 一、基因突变： （一）突变类型 ： 基因突变与诱变育种 细胞形态 形态突变型 菌落形态 营养缺陷型 生化突变型 抗性突变 抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的 改变） 致死性突变型（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现 出致死突变） 条件致死突变型：如突变为温度敏感型（37死， 25 活） 其它突变型：毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等 按表型分 温度敏感型突变 基因突变与诱变育种 （二）突变的特点： 1）不对应性：环境与变异无对应性 2）自发性：非人为的诱变因素下发生 3）稀有性：生物体的自发突变率为10-1010-12 4）独立性：一个基因的突变对其它基因突变无 影响 5）诱变性：诱变剂可提高突变率10105倍 6）稳定性：突变性状稳定、可遗传 7）可逆性：有回复突变 基因突变与诱变育种 （三）基因突变自发性及不对应的证明 ： 基因突变与诱变育种 变量彷徨试验： 涂布试验试验： 平板影印培养试验 ： 自发突变：没有人工诱变因素的参与，生物体的自然突变 1.变量彷徨试验： 1)抗性细胞的出 现，是在接触噬 菌体之前； 2)喷上噬菌体， 仅起淘汰野生型 和鉴别抗性株作 用； 3)由于甲方高度 彷徨，说明突变 是随机的。 基因突变与诱变育种 2. 涂布试验 基因突变与诱变育种 1、突变与噬菌体 无关； 2、涂布使抗性菌 株均匀分布； 3、抗性突变可在 任何时间发生， 与噬菌体存在无 关。 以上实验用统计学 原理间接证明。 3. 平板影印 基因突变与诱变育种 实验表明：从未接触 str 的菌株可发生抗性突变， 分离可得到纯的 str r 菌株。 由此表明： 突变是自发的与环境不对应的。 基因突变与诱变育种 （四）基因突变的机制：（自学） （五）紫外线(U.V)对DNA的损伤及修复: （自学） 二、突变与育种 （一）自发突变与生产育种 基因突变与诱变育种 1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出 生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化 。 2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物 群体,同时不断对其移种、传代，以达到积累 和选择合适的自发突变 体的一种育种方法. 3、自发突变的机制： 自发突变(spontaneous)：在非人为的情况下由于 遗传 物质的微小变化引起的性状变异。 原因可能是： 1）环境因素； 2）自身有毒产物的积累； 3）互变异构效应； 4）环出效应等。 基因突变与诱变育种 （二）诱变育种 1. 概念： 诱变育种是用物理或化学的诱变剂 使诱变对象内的遗传物质（DNA） 的分子结构发生改变，引起性状变 异并通过筛选获得符合要求的变异 菌株的一种育种方法。 基因突变与诱变育种 2. 诱变剂： 2）种类： 物理因子（phisical agents) 化学因子(chemical agents) 转座子(transposable elements) 物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。 基因突变与诱变育种 1） 概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。 化学诱变剂： 烷化剂 (alkylating agents)： 如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质 碱基类似物 (base analogs)： 如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等； 机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱 基类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复 制时出现突变体。 基因突变与诱变育种 插入剂 (intercalating agents): 如：溴化乙啶等一些三环分子。 机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子 不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间 距，引起碱基增加。 基因突变与诱变育种 3. 诱变程序： 基因突变与诱变育种 原始菌种 纯化 斜面/肉汤培养 单孢子/单细胞悬液 诱变剂处理 平板分离 移至斜面 小试 中试 初筛 复筛 计算存活率 观察形态变异 ，挑单菌落 良种保藏 原菌种特性鉴定 4. 诱变的主要环节 1）诱变剂的选择 ： 基因突变与诱变育种 1. a. 了解诱变剂的性质、作用机理和使用 方法 2. b. 处理方式： 3. 单一因子处理： 4. 复合因子处理：两种以上因素 先后使用 同时使用 单一因子重复使用 c. 处理剂量：测致死率。 方法 平板菌落计数法 纸片法 一般杀菌率为70%左右。 基因突变与诱变育种 Ames test：对化学诱变剂做检测 菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his -； 原理： his -在基本培养基上不长 ；而发生回复突变则长 。 基因突变与诱变育种 Ames test 方法示意图 用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品的中致癌物 基因突变与诱变育种 2）出发菌株： 育种的原始菌种；应具备： 对诱变剂的敏感性高； 生产中选育过的自发变异菌 株； 本身具有一些有利性状； 对代谢产物有一定积累； 已经发生过某些变异。 基因突变与诱变育种 3）单孢子或单细胞悬液的制备 a. 必要性： 单细胞可以均匀地接触诱变剂 避免出现不纯的菌落菌种退 化 基因突变与诱变育种 1. b. 制备： 2. 物理诱变剂生理盐水（ 0.85%NaCl) 3. 化学诱变剂缓冲液 4. c. 方法： 三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。 d. 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml 基因突变与诱变育种 4)设计和采用效率高的筛选方案和方法 初筛： 平板上做定性、半定量的测定，观察突变株 的生理效应范围。 方法：梯度平板法；（抗性菌株） 纸片法； （抗性菌株） 透明圈法；（淀粉酶产生菌株等） 变色圈法；（氨基酸生产菌株） 基因突变与诱变育种 如：用梯度平板法筛选抗性菌株 基因突变与诱变育种 抗生素法直接筛选抗药性突变体 基因突变与诱变育种 复筛： 较精确的生物化学分析方法 做摇瓶测定 （见P250） 基因突变与诱变育种 三、营养缺陷型的筛选 （一）概念： 基因突变与诱变育种 1. 三种遗传型个体 营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能 力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应 有机养分才能正常生长的变异菌株。 如：lys - ; bio - ; 野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在 其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为 该微生物的野生型。如：lys + ; bio + ; 原养型 (prototroph) ：指auxo突变菌株回复突变或重组 后产生的菌株，与野生型的表型相同。 2、筛选用的培养基 基本培养基（minimal medium,MM）-：满足野生 型菌株营养要求最低成分的组合。 完全培养基（complete medium,CM）+：满足一 切auxo生长的天然或半组合培养基。 补充培养基（supplemented medium,SM）x：在 MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应 auxo生长的组合培养基 。 基因突变与诱变育种 （二）筛选方法 auxo的鉴定 基因突变与诱变育种 诱变处理 auxo的浓缩 auxo的检出 1. 诱变处理（同前） auxo的筛选程序： 基因突变与诱变育种 细菌培养离心洗涤诱变处理 CM后培养洗涤MM加PN 涂布于CM平板影印培养挑取 鉴定 菌种保存 2. auxo的浓缩： 基因突变与诱变育种 1）抗生素法： 原理： 青霉素、制 霉菌素等抗生素作 用于生长着的微生 物细胞，对休止态 细胞无作用。 方法：菌培养在含 抗生素的MM基中。 2）菌丝过滤法： 适用于丝状 （放线菌、 霉菌） 原理：基本培养 基上只有发育 成菌丝；auxo 孢子可通过滤 膜，野生型菌 丝不能通过。 基因突变与诱变育种 3）差别杀菌法： 基本培养基上只有 野生型生长，加热 杀死野生型营养体 ，保留auxo芽孢。 细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢 子菌。 基因突变与诱变育种 3. auxo的检出 1）逐个检出法 基因突变与诱变育种 2）影印平板培养法 3）限量补充法 （在mm中加0.01%蛋白胨， auxo菌落小，野生型菌落大） 基因突变与诱变育种 3）夹层培养法 4. auxo的鉴定 基因突变与诱变育种 1）生长谱法 方法简便； 回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片 混合氨基酸法步骤 ： a. 将多种营养因子编组 ， 如： 一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 15 基因突变与诱变育种 2）混合氨基酸（Vit）法 1）每组内无重复的营 养因子 2）每组中应包含只出 现一次的因子 3）每组中其他因子应 分别出现二次 营养因子分组编排时注意 ： 基因突变与诱变育种 b. 将组合液的纸片放 在涂菌的基本培养基 上培养 c. 结果分析 a. 将多种营养因子编组 ， 如： 一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 15 5. auxo 的应用 1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种 、 代谢过程的研究中的亲本标记； 2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； 3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。 基因突变与诱变育种 第二节 基因重组 本节内容： 原核生物的基因重组 真核生物的基因重组 基因重组： 把两个不同性状个体内的遗传基因 转移到一起，经遗传物质重新组合后 ，形成新遗传型个体的方式。 基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平 基因重组 甲 生长快、产量低 乙 生长慢、产量高 基因重组 基因重组 如： 生长快、产量高 一、原核生物的基因重组 （一）转化（transformation) 基因重组 受体菌(receptor)直接吸收来自供体菌 (donor)的DNA片段，通过交换，将其整合到 自己的基因组中，再经复制就使自己变成一 个转化子(transformation)。 这种受体菌接受供体菌的DNA片段而 获得部分新的遗传性状的现象，称转化或转 化作用。 概念： 1. 感受态 基因重组 不同菌株的亲缘关系 受体细胞是否处于感受态 感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实 现其转化的一种生理状态。 不同菌出现感受态的时间不同。 转化的决定因素： 2. 感受态因子 一种胞外蛋白质，分子量为510kD 基因重组 其作用为： 催化转化，促进外来DNA片段吸收 可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露 1）不同菌细胞DNA受体位点不同 2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用 3. 转化因子： 转化因子的本质是供体DNA片段 一般为线状或闭合环状；单链或双链； 转化的频率往往很低，一般为0.11%。 据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的 转化因子，其转化频率最高 基因重组 4. 转化的检出 甲（受体） strr，lys- 基因重组 如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化 乙（供体） strs，lys+ 在含str的MM上培养 转化的全过程（以噬菌体为例 ） 基因重组 （二）转导(transduction) 以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA 片段携带到受体细胞中，通过交换与整合 ，从而使后者获得前者部分遗传性状的现 象，称为转导。获得新遗传性状的受体细 胞，称转导子。 基因重组 概念： 转导以温和噬菌体为媒介，其从宿主 DNA上诱导裂解时可能有三种情况： 1）包入的完全是噬菌体的DNA（噬菌体） 2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体） 3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体 ） 基因重组 1. 普遍转导（generalized transduction ） 1）完全转导(complete transduction)： 由完全缺陷噬菌体将外源DNA片段导入受体细胞，经交 换、整合、复制形成遗传性状稳定的转导子。 此时受体细胞的特点：a. 不发生溶源化； b. 不显示免疫性； c. 不会裂解产生正常噬菌体。 2）流产转导(abortive transduction)： 外源DNA片段不经交换、整合、复制，仅转录、转译和 性状表达。 特点：子代只有一个细胞带有重组子性状。 基因重组 由完全缺陷噬菌体介导的转导现象 。 2. 局限转导： 指通过部分缺陷噬菌体把供体菌的少 数特定基因携带到受体菌中，并获得表达 的转导现象。 基因重组 部分缺陷噬菌体： 噬菌体带有宿主gal基因dgal噬菌体 噬菌体带有宿主bio基因dbio噬菌体 特点：a、无正常溶源化能力； b、受体细胞不具免疫性。 根据转导频率的高低，可分为： 1）低频转导（LFT）： 部分缺陷噬菌体比例低，获得局限转 导子量极少。 2）高频转导（HFT）： 双重溶源菌：感染dgal噬菌体后，又感染正 常噬菌体，且同时整合在菌染色体上 。 HFT裂解物：诱导裂解双重溶源菌，裂解物 中含等量的两种噬菌体，称此裂解物为 。 高频转导：用低感染复数的HFT裂解物感染 另一gal-受体菌时，可高频地将其转化 为gal+转导子，这种方式称 3. 溶源转换与转导的区别（自学） 基因重组 （三）接合(conjugation) 供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传 递大段DNA的过程。在受体细胞中发生交换、 整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称 为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就 称接合子。 基因重组 概念： （四）原生质体融合（protoplast fusion ） 使遗传性状不同的两细胞的原生质 体发生融合，并发生遗传重组以产生融合子 （fusant）的过程。 基因重组 已成功地应用与植物细胞、真菌细 胞、属间、科间的远缘细胞融合，融合 产物含两亲代细胞基因组。 过程： 基因重组 二、真核微生物的基因重组 基因重组 （一）有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的 染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育 种技术。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌 ，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种 相似的有性杂交方法进行育种。 （二）准性杂交（parasexual hybridization） 同种异株的两个体细胞融合，不经 减数分裂而导致低频基因重组发生的一 种繁殖方式。（单倍体体细胞重组） 基因重组 1. 准性生殖 2. 准性生殖的意义： 对一些没有有性过程但有重要生产价值的半 知菌来说，进行基因在染色体上定性研究、杂交 育种，准性生殖提供了一个重要的手段。 发现存在构巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和 放线菌中，使之有普遍意义。 3. 过程 1）菌丝联结（anastomosis）; 2）形成异核体（heterocaryon）; 细胞质、核交流形成异核菌丝体。 3）核配（caryogamy)形成杂合二倍体; 特点：频率低，10-510-7 促成：樟脑熏蒸、紫外、高温 4）体细胞交换和单倍体化 基因重组 半知菌的准性生殖示意图 基因重组 异核体的特点 ： 1）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体； 2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ； （基因互补功能） 3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基 上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合 二倍体（重组子）。 基因重组 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。 同核体：同一菌丝中只有一种核。 体细胞交换和单倍体化 杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂 的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（ 单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双 倍体及非整倍体。 AB A+B （同核体） （异核体） A A B B AB A A B B （杂合二倍体） 单倍体杂合子 基因重组 4. 检出： 1）若MM和CM上差别不大的，为稳定 的杂合二倍体 2）若MM上不长，CM上大量长，为不 稳定异核体 基因重组 第四节 菌种的衰退、复壮及保藏 一、菌种的衰退和复壮 1.衰退： 概念：菌种经长期的人工培养或保藏，在 其自发突变的影响下，引起某些优良 性状变弱或消失的现象，称为衰退。 菌种的衰退、复壮及保藏 现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力或其对宿主寄生 能力下降； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 衰退的原因： 有关基因负突变 1）多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏： 细菌：1个月 酵母菌：3个月 放线菌、霉菌、芽孢：半年 2）培养条件； 3）诱变时出现不纯菌落。 菌种的衰退、复壮及保藏 2. 防止衰退的方法： 控制传代次数； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代； 采用有效的菌种保藏方法。 菌种的衰退、复壮及保藏 3. 菌种的复壮： 复壮：使衰退的菌种恢复原来优 良性状的方法。 复壮的方法： 1）纯种分离： 菌落纯（划线法、涂布法、倾注法 ） 菌株纯（单细胞挑取法） 2）通过寄主体进行复壮； 3）淘汰已衰退的个体。 菌种的衰退、复壮及保藏 二、菌种保藏： 1. 目的： 存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种 2. 原理： 创造一定条件，尽可能降低微生物代谢活 动强度，使之基本上处于休眠状态。 条件：1）挑选优良纯种的休眠体； 2）创造适合长期休眠的环境条件（干燥、低温 、 缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等） 菌种的衰退、复壮及保藏 3. 方法 ：