绿原酸含量测定.doc

绿原酸提取与测定绿原酸（chlorogenic acid）是一种从双子叶植物（如忍冬叶、咖啡豆、向日葵）的叶和果实分离得到的酚类,也是许多中草药（如杜仲、金银花、茵陈等）及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinic acid,即1-羟基六氢没食子酸)缩合而成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinic acid),分子式为C16H18O9,分子量:345.30，半水合物为针状晶体，110时变为无水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色固体。绿原酸在植物中分布广泛,从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡、可可树。植物的不同品种、发育阶段、同一植株的不同部位、存放时间、生长环境等均能影响植物中绿原酸的含量。以杜仲为例：叶中绿原酸的含量高于皮中含量数倍之多；用不同干燥方法对绿原酸含量的影响研究中,用阴干、晒干、直接烘干所测绿原酸含量分别是2.21%、2.17%和2.24%;鲜叶绿色含绿原酸3.52%,放置1年后,叶色棕绿,绿原酸含量为2.47%。由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇、水，难溶于氯仿、乙醚,因此绿原酸的提取方法较多，有醇（甲醇、乙醇）溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。下面介绍几种提取方法。醇溶法：先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色;再改用95%工业乙醇提取,提尽绿原酸;将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏,与干净细沙拌合后,用热水提取数次,使绿原酸转溶于水中,弃去残渣;所得水溶液用乙醚萃取,进一步除去脂溶性杂质;向脱脂后的水溶液中加入饱和无机盐溶液,至沉淀完全,并稍有过量为止。此时,水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐;用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后,将所得滤液用有机溶剂萃取数次,回收溶剂,得绿原酸粗品,经分步结晶和重结晶等方法精制,即得绿原酸纯品,得率约为0.5%。水提醇沉法：采用水为溶剂,加热煮沸提取,但相应地增加其他水溶性成分如蛋白质、多糖、鞣质等杂质,可用传统的醇沉法除去。醇沉过程中伴随吸附和包夹,致使绿原酸有不同程度的损失。提取水提液中绿原酸时,分次醇沉比一次醇沉所得产品纯度高;当乙醇浓度最终为90%时,一次醇沉的损失率比分次醇沉较大。水提石灰乳沉淀法：在待测物水溶液中,加石灰乳使绿原酸生成钙盐沉淀,用稀酸分解,提取物中绿原酸得率较低,可能因为绿原酸是酯类,被强碱水解所致。虽然许多研究者对绿原酸含量的测定方法进行了研究或评述,在分析、测定过程中不乏采用层析方法,但各种方法均有其不完善之处，难以分离出全部绿原酸并得到纯品（不包括绿原酸异构体）。同样，绿原酸的含量测定方法有许多种。由于许多物质同绿原酸分子结构相似,同存于一种药材或制剂中。因此在进行含量测定时常难以分离。常用分析方法有紫外分光光度法(UV)、高效液相色谱(HPLC)法等。这些方法要么难以完全分离待测物质，要么易受干扰，或者分析时间长、效率低。现在在中药成分分析中开始采用一种新技术即高效毛细管电泳(HPCE) 技术。它具有高分离效率、分析时间短、进样量少、低检测限和重现性好等特点。但由于在中药材的成分分析中才刚应用，效果如何还有待评价。下面介绍一种检测方法。1. 标准曲线的绘制精密称取绿原酸标准品80mg，用95%乙醇溶解，转移到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml到250ml容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。在330nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出相应的回归方程。2 . 样品中绿原酸含量的测定（1）提取液的制备 准确称取中草药提取物样品各1.0835g，置于250ml锥形瓶中，量取约50ml95%的乙醇溶解样品，并置于85的恒温水浴箱中，回流4h。放置、冷却至室温，过滤，然后加95%的乙醇将提取液定容于250ml容量瓶，待用。（2）含量测定 准确吸取样品提取液5ml于25ml容量瓶中，加95%的乙醇稀释到刻度，得到待测样品液。以95%的乙醇作空白，在330nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。3 . 回收率的测定准确称取中草药提取物样品0.20g，分