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分子标记技术在中药分类及资源保护中的应用进展 作者：郭宝林 刘万水 陈玉婷 朱曼萍 王丹红 王建辉【关键词】 分子标记技术 中药分类 资源保护分子标记技术一般是指研究核酸及蛋白质等携带遗传信息的大分子特征的技术，分子标记可分为DNA分子标记和蛋白质分子标记。分子标记技术引入中药领域后被广泛地应用于分类、鉴别和保护等各个层面，受到越来越多的重视。本文将重点介绍在中药分类和资源保护方面的应用。1 DNA分子标记DNA分子标记是随着核酸分子技术的发展而发展起来的,已被应用于生命科学的各个领域，特别是在系统进化、保育遗传学、品种鉴定及良种选育、遗传图谱构建、基因定位等方面得到了广泛应用。根据DNA 分子标记所采用的核心技术大体上可分为三类：一是以分子杂交为基础的DNA指纹技术；二是以PCR为基础的DNA指纹技术；三是DNA序列标记技术。1.1 基于分子杂交的DNA指纹技术基于分子杂交的DNA指纹技术可分为RFLP,SSR等技术，这些技术的实验过程一般要包括限制性酶切、Southern印记、探针标记、分子杂交等繁琐的实验步骤，且只能检测出探针长度范围内切酶识别位点的变异，多态性检出效率低，同时要求的DNA量比较大，因而限制了其在实际中的应用。本类技术在植物系统与进化研究中有很多成功的例子，但在中药领域目前应用得较少，这里不做重点介绍。1.2 基于PCR基础的DNA指纹技术基于PCR的指纹技术近年来层出不穷，它们各有其优缺点和适用范围。这里根据各技术在中药领域中应用的潜力及普遍性等方面重点介绍以下几种：随机扩增长度多态性DNA（RAPD）、基于PCR的简单重复序列（PCR-SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、基于PCR的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、直接扩展增长度多态性（DALP）。1.2.1 RAPDRAPD是以10碱基的任意序列寡核苷酸片段为引物，在未知序列基因组DNA上进行随机扩增以研究样本间遗传差异的指纹技术，是当今在中药研究领域中应用的最广的分子标记技术，如分类和遗传关系分析、遗传多样性评价、资源保护等，起到了非常重要的作用。遗传关系分析：RAPD分析和等位酶标记都被广泛地用来研究物种的遗传多样性，但能检测到比等位酶高的多样性信息。邵爱娟等1利用RAPD对栽培人参不同品系之间的遗传多样性进行研究，从分子水平证明了根据表征性状对人参栽培类群进行划分是可行的。郭宝林等2利用RAPD技术探讨了中药厚朴种内关系和道地性问题，并将所得结果与形态学及指标成分相联系，最终认为厚朴应分为3个地理综，道地性主要来源于遗传变异。方芳等3在进行浙江产香茶菜属植物8个类群的RAPD分析时发现，各类群存在明显的分化，同属不同组的大萼香茶菜与香茶菜的遗传关系很接近，甚至小于同组的香茶菜与显脉香茶菜之间的遗传距离。郑喜珍等4在研究中、韩牛膝类药材的遗传关系时发现，RAPD聚类图很好地区别了牛膝与土牛膝，而韩国产牛膝则与怀牛膝差别不大，支持了中国植物志对二者的处理，并建议韩国药典予以更正。任如冰等5利用RAPD技术来评价苍术居群间的亲缘关系，结合前人对苍术精油成分的聚类分析，将10个居群划分为3个类群，并支持了将北苍术作为变种处理的观点，从而为道地药材的引种栽培提供了分子水平上的依据。遗传多样性和资源保护：宋卫华等6利用RAPD对三峡库区稀有药用植物裸芸香进行遗传多样性的研究时发现各居群间已有较大的分化，居群内遗传水平较低，但总体上仍有较高的多样性，并根据各居群地理隔离程度大、基因流较小且处在库区消涨带上的实际情况，给出了保育建议以促进种群的恢复7，8。利用RAPD技术对珍稀濒危药用植物金铁锁多和丽江山慈姑态性进行DNA 指纹检测时，发现尽管各居群内遗传多样性较为丰富，但居群间分化较大7，8，在进行种质资源保护时，应该对居群内与居群间给予同等重视。1.2.2 PCR-SSR 微卫星DNA（SSR）是短的、串联的简单重复序列，组成基元是16核苷酸，广泛存在于真核细胞的基因组中。由于串联重复的数目是可变的且呈现出高度的多态性，以及在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析，微卫星序列作为比较理想的分子标记广泛用于遗传图谱的构建、居群遗传学和系统发育研究。PCR-SSR目前一般常用的技术有微卫星引动的PCR（MP-PCR，利用SSR单引物扩增）及锚定PCR-SSR、微卫星位点的PCR扩增（SSLP），ISSR（扩增重复位点之间的区域）等几类，前几种方法在中药领域应用的较少，这里重点介绍应用最为广泛ISSR。1.2.3 ISSR是由Zietkiewicz 等9发明的利用重复锚定引物扩增SSR之间的片段，且一套引物可以在多种植物中通用，是一种非常理想的检测遗传变异的分子标记。邱英雄等10研究了明党参与川明参群体遗传结构，证明两者在DNA水平出现了相当的遗传分化，并发现一个川明参特有的遗传标记，因此支持将明党参与川明参作为两个种处理。周延清等11在PCR-ISSR反应体系中加入2%去离子甲酰胺降低模糊背景，仅用一个引物就鉴别了实验所用的10个怀地黄品种。葛永奇等12对江苏泰兴、美国纽约栽培的银杏群体和中国3个可能为野生的银杏自然群体（浙江天目山、贵州务川、湖北大洪山区）的遗传多样性水平和群体遗传结构进行了研究后发现：群体遗传多样性以贵州务川最高，美国纽约的栽培群体最低；在聚类时，务川群体与天目山群体首先聚成一类，美国纽约群体则与湖北大洪山群体具有较近的亲缘关系，并结合遗传结构的分析和生态学研究结果，给出了银杏保护的策略。彭云滔等13研究了采自广西和广东罗汉果野生居群的样品，认为罗汉果各居群点的遗传多样性存在较大的差异，且居群间产生了较大的遗传分化，因此在进行保护重点地区种质资源时也要注意其它地区野生罗汉果的保护和利用。杨淑达等14在对我国西南地区特有植物滇牡丹进行ISSR分析时指出，该物种遗传多样性水平较高，居群间分化较大，造成其濒危的主要原因应为生境破坏和滥采滥挖。1.2.4 AFLPAFLP基本原理是对基因组DNA进行限制性酶切，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相结合作为扩增的模板，接头及相邻的几个碱基序列做为引物的结合位点进行PCR扩增得到多态的DNA指纹，常常用于种质资源评估、遗传关系等方面的研究中。虞泓等15对石斛属内石斛组4个种和一个未知类群种进行基因组DNA多态性分析， 发现5种石斛单独聚类，同时两个金钗石斛居群在种下分别聚类，为进行石斛的分类鉴别提供了分子生物学基础。王晓梅等16检测了雌雄银杏基于DNA的差异，筛选出与银杏性别有关的分子标记，其中3个引物组合各提供了1个与雌性相关的标记，这为寻找性别特异的探针或PCR引物，用于银杏性别鉴定奠定了基础。周世良等17利用野生屏边三七作对照，采用4个引物组合对3个种植场的三七进行分析，并对比ITS测序结果，认为三七变成栽培作物后，有比较严重的遗传多样性的丧失，但仍存在着变异，对保存了相对较高遗传多样性的居群应重点保护，同时考虑到居群间仍存在较大的遗传变异，其相邻居群也应予以保护。1.2.5 PCR-RFLPPCR-RFLP是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切位点分析。韩国Um Jae Young等18应用RAPD和PCR-RFLP技术对4个韩国与中国产人参进行了检测分析，结果发现韩国产人参DNA指纹具有极大的差异性，可以互相区别。1.2.6 DALP直接扩增长度多态性（DALP）是由 Desmarais等19开发的，是基于生物体中普遍存在大量M13序列，利用经过修饰或未经修饰的M13通用引物对进行PCR扩增来研究基因组DNA长度多态性的一种技术。DALP一般使用的引物（2027 mer）较长，可以适合较为严格的扩增条件，包括相对高的退火温度和低氯化镁浓度，因此可以得到重复性好的结果。在引物扩增时可采用两种策略以适应不同的实验要求：一种是在进行扩增时每个样本需要通过同一对引物组合进行两次独立的PCR扩增反应（但每次只将组合对中的一个引物标记），在分析时可将两次结果在同一张图谱上对比，只分析那些由两条引物扩增的条带，进一步减少由同一引物扩增引起的非特异性干扰；另一种是不经引物标记，只做一次扩增，直接将扩增产物进行检测，比较不同样本DNA多态性的差异，以缩短实验周期、降低实验成本。DALP现已经成功用于检测不同类群生物（如病毒、脊椎动物和无脊椎动物）的亲缘关系和多态性的研究2022，但目前在中药分类与保护领域中，应用的还比较少，如：夏惠茵等23在利用DALP鉴定人参与西洋参时，降低了选择性引物/反向引物的比率来解决反向引物亲和性的问题并使用5055以减少背景干扰，建立了快速的PCR鉴别方法，鉴别了人参与西洋参；李永谊等24通过对PCR反应条件中主要参数的实验和比较分析，发现所有样品都可以得到5个引物的9条谱带，因此建立了可直接用于红景天药材品种鉴定的DALP反应体系。相信此项技术将越来越广泛地应用于中药分类与资源保护的各个层面。1.3 DNA序列标记技术DNA序列标记技术是直接测定生物体中的特定序列并进行遗传差异分析的一种技术。目前常用的序列主要有核基因组的rRNA，ITS等；植物叶绿体基因组的rbc族基因 、trnK及其内含子matK 基因、rpoC 基因、rpl基因等；动物线粒体基因组cyt- b 基因、12S rRNA等。高建平等25得到不同产地不同居群华中五味子和绿叶五味子总DNA之后测定相应的rDNA ITS 序列，发现绿叶五味子作为一个种较为合理，并且河南鸡公山产五味子均为本种。保曙琳等26通过ITS序列特征对长江中下游地区野生菱和栽培菱种的进行了系统学研究，他们认为菱属植物可能起源于同一种野生类居群。刘春生等27在获得北细辛、华细辛和汉城细辛完整的rDNA ITS序列，研究发现中药细辛3种原植物形成非常稳定的独立分支（其中北细辛与华细辛聚在一起，汉城细辛形成另外一个分支），但三者亲缘关系非常密切，说明它们相互替代入药是有遗传基础的。Komatsu等28测定了越南人参及其5种相关植物人参、西洋参、竹节参、假人参、珠子参的matK基因和18S rRNA基因序列，并进行了序列同源性比较，发现6种植物2个基因序列长度均相等，越南人参的18S rRNA和西洋参一致，而与假人参和珠子参各有一个碱基取代，其matK基因序列与珠子参、假人参、人参、西洋参分别在第4，5，9和10核苷酸位有差异，所建立的分子系统树表明，越南人参与其它5种植物具有重叠的地理分布，并和珠子参、假人参具有较近的亲缘关系。赵宣等29从代表牡丹组全部8个野生种材料中提取得到的编码三磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）的基因，并对经PCR-RFLP酶切处理所得的片段进行了测序分析，得到的关系树与形态学关系相当吻合。2 蛋白质分子标记蛋白质分子标记技术中的等位酶分析在中药分类及资源保护等方面应用较少。虽然与DNA标记相比，等位酶实验的分析方法已成为传统方法，但其自身所具有的优势仍然是十分突出的。例如，酶是生物进化过程所必不可少的，同源性可靠，存在于个体间、居群间或近缘种间，可以直接比较，因此等位酶位点分析可以从遗传学上把类群间的亲缘关系量化，增加了系统学和进化研究的可实验性和可重复性。因此通过比较通过遗传分析找到基因位点，能有效地度量群体遗传变异的大小及其分布30，31，且费用低廉、安全而有易于操作，对于在基因位点水平上研究保育遗传学、进化生态学和分子生态学仍具有广阔而实用的前景。何敬胜等32利用超薄平板聚丙烯酰胺等电聚焦电泳技术，通过8个酶系统19个酶位点对濒危物种巴东木莲7个居群进行遗传多样性及遗传结构分析，结果表明巴东木莲目前仍具有较高的遗传多样性并且在适宜生境中可以完成自然更新，并据此提出以就地保护为主的综合保育策略。李斌等33在对白皮松进行保育遗传学时发现，得到的53个等位基因中有46个为全局基因或广域基因，局域基因和特异基因只有7个，与松属中其它树种相比处遗传水平处于偏下水平。同时群体的等位基因频率与地理生态因子的相关分析表明，有两个基因频率呈明显梯度变异，这暗示了白皮松天然群体间流受到限制，难以克服自然环境选择作用，存在着明显的遗传分化。李晓东等34对8个栽培水杉居群作遗传多样性的等位酶分析时发现，栽培居群的遗传变异水平明显偏低，其遗传多样性不能涵盖孑遗居群，此外也不支持将从枝水杉作为水杉一个变种的处理。中药现代化的推进带来了中药发展的新机遇，期望将当今最新的技术和成果应用于中药的分类鉴别和资源保护。随着生物化学和分子生物学的发展，会有越来越多新的方法产生，但由于技术本身与中药研究的结合需要一定的过程，目前很多方法仍处在起步阶段。例如单核苷酸多态性（SNPs），SNPs是由单个碱基的转换或颠换引起的一种古老而高度稳定的突变（尤其是处在编码区的cSNP）。因此对于大规模的研究而言，其比微卫星和其它的重复序列更可靠35。SNPs除了制作遗传图谱以外，还能用于种质资源的DNA指纹分析和生物多样性检测，用于连锁不平衡的关联分析等方面的研究。由于SNPs发展与分析技术的飞速发展，特别是与生物芯片和DNA微阵列技术相结合，大大方便了基因组进行大幅度和高通量的分析，使其成为继RFLP和微卫星标记（SSR）之后最有前途的第3代分子标记。【参考文献】 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