医院感染微生物学监测.ppt

,医院感染微生物学监测,*省人民医院 感染管理科, 感染暴发或感染流行时，环境因素在感染中有流行病学意义, 监测潜在的危险环境，证明有危险的病原体存在或证明危险 病原体已被成功清除, 当某项感染控制措施改变时，评价其效果；或根据要求，仪器设备或系统启用时进行监测, 询证医学证据支持,采样后应尽快对样品进行相应指标的检测 送检时间不得超过4h 若样品保存于04时 送检时间不得超过24h,采样和检查原则医院消毒卫生标准(2011),不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查 当流行病学调查怀疑医院感染事件 与灭菌物品有关时，进行相应物品的无菌检查 常规监督检查可不进行致病性微生物检测 涉及疑似医院感染暴发、医院感染暴发调查 或工作中怀疑微生物污染时 应进行目标微生物的检测,采样和检查原则医院消毒卫生标准(2011),采样和检查原则医院消毒卫生标准(2011),可使用经验证的现场快速检测仪器进行环境、物体表面等微生物污染情况 和医疗器材清洁度的监督筛查 也可用于医院清洗效果检查和清洗程序的评价和验证,ATP荧光检测仪,医院消毒技术规范(2011) 医院消毒卫生标准(2011) 医院感染管理规范,监 测 内 容, 医院空气微生物学监测, 物体表面微生物学监测, 使用中消毒剂微生物学监测, 医务人员手微生物学监测, 压力蒸汽灭菌效果生物监测, 环氧乙烷灭菌效果生物监测, 医疗器械消毒效果监测, 医院治疗用水的细菌学检测, 血液透析液内毒素监测,采样时间,消毒后 操作前,监测方法,沉降法,重力沉降（平板沉降法） 静电沉降 热沉降,浮游菌测定法,撞击式空气微生物采样法 离心式空气微生物采样法 洗刷式空气微生物采样法 过滤空气微生物采样法 温差空气微生物采样法 静电或冲击空气微生物采样法,未采用洁净技术净化空气的房间： 平板暴露法,室内面积30m2 设内、外、中 对角线3点 内、外点距离墙壁1m处,室内面积30m2 设四角及中央共5点 四角距离墙壁1m处,1、平板暴露法 2、空气采样器法 参照GB50333-2002（医院洁净手术部建筑技术规范）,采用洁净技术净化空气的房间：,手术区：手术台及其周围的区域,级手术室 (手术区百级，周围千级）： 手术台两侧边至少各外推0.9m 两端至少各外推0.4m后（包括手术台）的区域,级手术室 (手术区千级，周围万级）： 手术台两侧边至少各外推0.6m 两端至少各外推0.4m后（包括手术台）的区域,级手术室（手术区域万级，周围十万级）： 手术台四边至少各外推0.4m后（包括手术台）的区域,级手术室（三十万级）：不分手术区和周边区,周围区：除去手术区以外的其他区域,平板暴露法,局部百级 周围千级设置13点,局部千级 周围万级设置9点,局部万级 周围十万级设置7点,局部十万级 周围三十万级设置5点,?,医院洁净手术部建筑技术规范 GB50333-2002,当用沉降法测定沉降菌浓度时 细菌浓度测点数既要不少于被测区域含尘浓度测点数 又应满足沉降菌最少培养皿数,被测区域洁净度的级别 最少培养皿数（90，30min计） 100级 13 1000级 5 10000级 3 100000级 2 300000级 2,局部千级设置5点 周围万级设置4点,局部百级设置13点 周围千级设置6点,局部万级设置3点 周围十万级设置2点,局部十万级设置2点 周围三十万级设置2点,操作方法,将平皿（直径9cm）放置在采样点处 采样高度距离地面80-100cm 采样时将平皿盖打开、扣放于平板旁,采样时，必须有2次空白对照 第1次对用于检测的培养皿或培养基条做对比试验 每一批做一个对照皿 第2次是在检测时，每区或每室1个对照皿 对操作试验做对照试验 模拟操作过程 但培养皿或培养基条打开后又迅速封盖 两次对照试验都必须为阴性 整个操作过程都必须无菌操作,未采用洁净技术净化空气的房间暴露5min 采用洁净技术净化空气的房间暴露30min,未采用洁净技术净化空气的房间 类环境暴露15min 、类环境暴露5min 采用洁净技术净化空气的房间暴露30min,采样后盖好平皿盖子 记录采样时间,采样平皿6h内送实验室培养 置361恒温培养箱培养48h 计数每个平板的菌落总数,若怀疑与医院感染有关时 进行目标微生物检测,平板暴露法采样注意事项：,布点应尽量避开高效送风口正下方,放置培养皿时 应从最里面的房间或房间的最里面开始布点 依次向外 最后人员撤出,收集培养皿时 从最外面的房间或房间的最外面开始 最先布的点最后收,采样前关闭门窗 无人走动的情况下 静止10分钟后采样,对检测人员的要求：,着无菌的工作服、戴口罩、帽子 操作前洗手或手卫生,手臂及头部不可越过打开的培养皿上方,行动及放置动作要轻 尽量减少对空气流动状态的影响,每次采样人员不得超过2人,所带物品徐清洁后方可带入,结果计算,奥梅良斯基公式（奥氏公式）： 5分钟在100cm2的面积上降落的细菌数 相当于10L空气中所含的细菌数,细菌数（cfu/m3)=,50000N,At,t-平皿暴露于空气中的时间（分钟） N-培养后，平皿上的细菌总数 A-所用平皿的面积,（2002版消毒技术规范）,2011年消毒技术规范,平板暴露法 按平均每皿的菌落数报告：cfu/皿暴露时间,例如： 产房30m2 放置平皿5个 放置15min 培养后5个平皿共长菌落15个 该产房空气培养的结果为 平均每皿的菌落数 3cfu/皿15min,空气采样器法（浮游菌测定法）,二级 撞击式空气采样仪,六级 撞击式空气采样仪,八级 撞击式空气采样仪,推荐使用六级撞击式空气采样器 或其他经验证的空气采样器,6层有微小孔眼的铝合金圆盘 圆盘下放琼脂平皿 圆盘间有密封胶圈 通过三个弹簧卡子把圆盘固定联在一起 标准采样流量为1立方尺28.3L/min, 提前联系需采样的科室 安排好采样的时间以及房间的准备 百级洁净房间至少已运行15分钟 其余洁净度房间至少已运行40分钟,空气采样仪（浮游法）采样步骤和方法, 采样仪需提前充电10小时, 采样点: 洁净房间每间需要采样至少2个点 一次采样需要2个空白对照, 采样的布点： 中央区和周边区 房间大于10m2 每增加10m2 增设一个采样点 在平皿上要标注房间号和采样区域及采样时间, 采样的高度： 将采样器置于室内中央0.8m1.5m高度, 采样的角度： 在100级区域检测时，采样口应对着气流方向 在其他级别区域检测时，采样口均向上, 采样的时长： 百级中央区30分钟 其余洁净房间均为10分钟（至少2分钟） 采样时间不应超过30min, 采样时要注意无菌操作： 操作者：带口罩、帽子，穿隔离衣 换鞋或穿鞋套；手卫生 安装进气盖前需用酒精灯灭菌进气端盖正反两面, 空白对照的设置： 空白对照1：培养皿不打开 空白对照2：模拟操作过程 但培养皿打开后又立封盖 两次对照必须均为阴性。,被测区域洁净度级别 最小采样量m3(L) 100级 0.6(600) 1000级 0.06(60) 10000级 0.03(30) 100000级 0.006(6) 300000级 0.006(6),浮游菌法最小采样量,培养皿的准备要求,配置平皿的试验台需要使用水平仪提前校正 保证加注培养基后平民内琼脂厚度均匀,需提前培养24h（为证实无菌）,空气采样器法计算公式,空气中菌落总数（cfu/m3）,采样器各平皿菌落数之和（cfu）,采样速率（L/min) 采样时间(min),1000,=,合格标准,类环境：采用空气洁净技术的诊所， 分洁净手术部和其他洁净场所,类环境：非洁净手术部（室）；产房；导管室； 血液病区、烧伤病区等保护性隔离区； 重症监护病房；新生儿室等,类环境：消毒供应中心的检查包装灭菌区 和无菌物品存放区；母婴同室； 血液透析中心（室）；其他普通住院病区,类环境：感染性疾病科门诊和病区； 普通门急诊及其检查、 治疗（注射、换药等）室,类环境,洁净手术部：要求符合GB50333要求,类区域：细菌总数4cfu/15min平皿,、类区域：细菌总数5cfu/5min平皿,浮游菌测定法的优点,能够采集浮游在空气中的微生物粒子 这种粒子可随人们呼吸道运动进入呼吸道 因而更具有卫生学意义,采样效率高 采样量准确 采样时不受粒径大小、沉降速度和气流的影响 能准确的表示出空气中细菌的实际含量,采样时间,消毒后,采样方法,5cm 5cm灭菌规格板 放在被检物体表面 用蘸有生理盐水的棉拭子1支 在规格板内横竖往返各涂擦5次 并随之转动棉拭子 被采表面100cm2，取全部面积 被采样表面100cm2，取100cm2 剪去手接触部分 将棉拭子投入装有10ml无菌检测用洗脱液的试管中送检 门把手等小型物体用棉拭子直接涂抹物体表面采样,采样物体表面有消毒剂残留时 采样液应含有相应中和剂,检测方法,倾注法,充分振荡采样管 取不同稀释倍数的的洗脱液1.0ml接种平皿 （每一标本接种2个平皿） 将冷却至4045的融化营养琼脂培养基 （ 4548） 每皿倾注15-20ml （15-18ml） 361恒温箱培养48h 计数菌落数,怀疑与医院感染暴发有关时，进行目标微生物的检测,涂抹法,将采样试管充分振荡或在混匀器上混匀30s 取100ul接种于平皿 均匀涂布 361恒温箱培养48h 计数菌落数,怀疑与医院感染暴发有关时，进行目标微生物的检测,结果计算,规则物体表面,小型物体表面,例如： 手术室手术床，面积100cm2 采样面积100cm2,涂抹法接种 培养48h后 平皿上的菌落数为10cfu 手术床的菌落总数 =（10100）/100 =10cfu/cm2,倾注法接种 培养48h后 平皿上的菌落数为100cfu 手术床的菌落总数 =（10010）/100 =10cfu/cm2,合格标准,使用中消毒液染菌量监测,证明被污染的消毒剂可以成为医疗机构感染和流行传播的媒介已有50年的历史 已经有报告证明污染的消毒剂导致医院感染的例子,消毒剂溶液中长菌常见有下列几种原因：,消毒剂的配制问题,消毒剂的外源性污染,消毒剂的储存问题,消毒剂本身成分的问题,美国CDC医疗机构消毒灭菌指南2008,采 样 及 操 作 方 法,1、涂布法,用无菌吸管吸取消毒液1ml 加入9ml相应中和剂中 充分振荡或在混匀器上混匀30s 取200ul接种于培养基平皿表面 均匀涂布,每份样品同时做2个平行样 一个平皿置于20培养7d 观察真菌的生长 另一平皿置于35恒温培养箱培养72h 计数菌落数,怀疑与医院感染暴发相关时 进行目标微生物检测,消毒剂染菌量（cfu/ml）= 每个平皿上的菌落数50,结果计算,2、倾注法,用无菌吸管吸取消毒液1ml 加入9ml相应中和剂中 充分振荡或在混匀器上混匀30s 分别取500ul接种于2个灭菌平皿内 加入已溶化的4548普通营养琼脂1518ml 边倾注边摇匀 待琼脂凝固,一个平皿置于20培养7d 观察真菌的生长 另一平皿置于361恒温培养箱培养72h 计数菌落数,怀疑与医院感染暴发相关时 进行目标微生物检测,消毒剂染菌量（cfu/ml）= 每个平皿上的菌落数20,结果计算,中和剂,在微生物杀灭实验中 用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中 和微生物表面上残留的消毒剂 使其失去对微生物的抑制和杀灭作用的试剂,中和剂选择原则,本身对菌无影响,生成物对菌无影响,确能去除杀菌因子,常用消毒剂的中和剂,合格标准,皮肤黏膜消毒剂染菌 10cfu/ml,灭菌剂染菌量 0cfu/ml,消毒剂染菌量 100cfu/ml,对未使用的低效消毒剂和皮肤黏膜用消毒剂 使用前应按照使用中消毒液染菌量的方法进行细菌检测 未检出细菌为合格,消毒剂有效浓度的监测,使用中消毒液的有效浓度应该符合使用要求 连续使用消毒液应定期进行有效浓度测定 每日使用，每日监测； 每周使用，每次使用前监测；,遵循WS/T 313,中华人民共和国卫生部行业标准 医务人员手卫生规范,手术室 产房 母婴室 新生儿室 口腔科 器官移植病房 层流洁净病房 烧伤病房 血液透析室 导管室 ICU 感染性疾病科 等部门,医疗机构应每季度对,医务人员手进行消毒效果监测,当怀疑医院感染暴发 与医务人员手卫生相关时 应及时进行监测 并进行相关致病微生物的检测,1、采样时间,手卫生后,接触病人或诊疗操作之前,2、采样方法,棉拭子法,被检人员五指并拢 用蘸有含相应中和剂的棉拭子 在双手手指屈面从指根到指尖往返涂擦2次 一只手的涂擦面积约30cm2 并随之转动采样棉拭子,剪去操作者手接触的部分 将棉拭子投入10ml含相应中和液的试管中 立即送检,3、检测方法,同物体表面消毒效果检验方法,4、结果计算,5、合格标准,、类区域：细菌菌落总数5cfu/cm2,类区域： 细菌菌落总数10cfu/cm2,类区域： 细菌菌落总数15cfu/cm2,不得检出治病微生物,监测时间：每周一次,指示菌株：嗜热脂肪芽胞杆菌 （ATCC7953或SSIK31株）,培养基： 溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基,该菌为需氧芽孢杆菌，革兰氏染色呈紫色 细菌芽胞孔雀绿着色 在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上表面呈粗糙呈米黄色,嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC7953或SSIK31株）,最适生长繁殖温度为5665，培养24h形成菌落 热死亡时间为121,嗜热脂肪芽孢杆菌菌片 染菌量为5105106cfu/片,检测方法,将嗜热脂肪芽胞杆菌菌片放入 灭菌的小纸袋内 置于标准实验包中心部位 标准生物监测包应置于灭菌器排气口的上方 或厂家建议的灭菌器内最难灭菌的部位,试验包制作,3件平纹长袖手术衣 4块小手术巾 2块中手术巾 1块大手术巾 30块10cm10cm纱布敷料 裹成25cm30 cm30cm大小,经过一个灭菌周期后 在无菌条件下取出试验包 或通气储物盒中的指示菌片 投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中 56培养48h 同时将未经灭菌的菌片投入另一管培养基中作对照 观察培养基颜色的变化,若指示菌片中的细菌未被杀灭 可分解培养基中的葡萄糖产酸 使指示剂溴甲酚紫 由原来的紫色变成黄色,对照管为黄色 灭菌合格仍为淡蓝色 灭菌不合格为黄色,自含式生物指示剂,使用方法,经过一个灭菌过程后 取出指示剂管 挤破内含的安瓿 与对照管一起放入 56培养48h,结果判断,灭菌合格,检测管培养阴性 阳性对照管培养阳性 阴性对照管培养阴性,灭菌不合格,检测管培养阳性 阳性对照管培养阳性 阴性对照管培养阴性,监测时间：每灭菌批次,指示菌株：枯草杆菌黑色变种芽胞 （ATCC9372）,培养基： 普通营养肉汤培养基,检测方法,取20ml一次性塑料或玻璃注射器 去掉针头和针头套 拔出针栓 将指示剂带孔的塑料盖应朝向注射器针头处 将注射器针栓插入原位 （不要接触到生物指示剂） 用一条全棉小毛巾折成两层包裹 置于纸塑包装袋中 封袋,将常规生物监测包放在 灭菌器最难灭菌的部位,同时设阴、阳性对照,灭菌周期完成后 立即将生物指示剂取出 361 培养7天,若用自含式生物指示剂 可直接挤碎置于37温箱中 培养48h观察结果,高度危险性医疗器械： 进入正常无菌组织、脉管系统或有无菌体液（如血液）流过，若被微生物污染将导致极高感染危险的器材 如手术器械；穿刺针；腹腔镜；活检钳；牙科手机及其配套器械；心导管；植入物等,消毒效果：应无菌生长,消毒水平：达到灭菌,中度危险性医疗器械： 直接、间接接触粘膜的器材 如胃肠道内镜；气管镜；喉镜；体温表（口腔测温表肛门测温表）；呼吸机管道；麻醉剂管道；压舌板；肛门直肠压力测量导管等,消毒效果：菌落数应20cfu/件、g或100cm2,消毒水平：高水平消毒或中水平消毒,氧气湿化瓶、吸引器、婴儿暖箱、加温加湿罐等 宜采用高水平消毒,低度危险性医疗器械： 仅与完整皮肤接触而不与粘膜接触的器材 如听诊器；血压计袖带；病床围栏、床面以及床头柜、被褥；墙面；痰盂、尿壶、便器等,消毒效果：菌落数应200cfu/件、g或100cm2,消毒水平：中水平消毒或低水平消毒或保持日常清洁,在消毒或灭菌处理后 存放有效期内采样,采样时间,可用破坏性方法取样的，如一次性输液（血）器、注射器和注射针等参照中华人民共和国药典无菌检查法进行。,灭菌医疗器材的检查方法,牙科手机采样：应在100级洁净实验室将每支手机分别置20-25mL采样液的无菌大试管（内径25mm）中，液面高度为4.5cm，于旋涡混合器上洗涤震荡30s，取洗脱液进行无菌检查。,对不能用破坏性方法取样的医疗器材，应在100级洁净实验室，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面100cm2，取全部表面；被采表面100cm2，取100cm2；然后将采样棉拭子进行无菌检查。,手机采样方法决定检测结果！,棉签涂擦法不能体现手机的无菌性！,（1）在洁净度100级区域中进行，严格无菌操作 （2）采样后送检时间不得超过6h 样品保存于4，则不超过24h （3）如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂 （4）采样面积，100cm2 （5）设好阳性、阴性对照,注意事项：,不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查,可用破坏性方法取样的，应在100级超净工作台称取110g样品，放入装有10mL采样液的试管内进行洗脱，取洗脱液接种平皿进行菌落计数（cfu/g），必要时分离致病性微生物。,消毒医疗器材的检查方法,可整件放入试管进行洗脱的，用洗脱液浸没后震荡30s以上，取洗脱液接种平皿，进行菌落计数（cfu/件），必要时分离致病性微生物。,对不能用破坏性方法取样的医疗器材，应在100级超净工作台，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面100cm2，取全部表面，被采表面100cm2，取100cm2，然后将采样棉拭子进行洗脱，取洗脱液接种平皿进行菌落计数（cfu/ cm2），必要时分离致病性微生物。,采样时间,消毒灭菌后 使用前,内窥镜消毒灭菌效果的生物监测,采样方法,监测部位为内镜的内腔面 用无菌注射器抽取50ml 含有相应中和剂的洗脱液 从待检内镜的活检口注入内镜（使用蠕动泵） 用无菌试管从活检出口收集注入的液体 2h内送检,检测方法,将洗脱液充分混匀 取洗脱液1.0ml接种平皿 将冷却至40- 45溶化的营养琼脂培养基 每皿倾注15-20ml 36 1恒温箱培养48h 计数菌落数（cfu/件）,将剩余洗脱液在 无菌条件下用滤过膜（0.45um）过滤浓缩 将滤过膜接种于凝固的营养琼脂平板上 置36 1恒温箱培养48h 计数菌落数（cfu/件）,合格标准,消毒内镜 细菌总数20cfu/件,灭菌内镜 无任何细菌检出,采样时间,消毒灭菌后 使用前,呼吸机麻醉机等螺纹管消毒效果生物监测,采样方法,用蘸有相应中和剂的长柄棉签 在被检螺纹管内面反复涂擦 并同时转动棉签,剪去手接触的部位 将棉签投入10ml含相应中和剂的 无菌生理盐水试管 立即送检,检测方法,同物体表面微生物学的检测方法,结果计算,细菌总数（cfu/cm2）=,平板上的菌落数稀释倍数,采样面积,采样面积 = 棉签涂抹采样的长度螺纹管内周长,血液透析相关治疗用水的细菌学监测,依据YY 0572血液透析和相关治疗用水进行检测,监测时间,最初监测应每周监测1次 连续2次监测结果符合要求后 改为每月1次,采样点,血液透析器与复用系统连接处 或尽可能接近此处,采样方法,用75%酒精擦拭采样口 酒精自然风干后打开采样口 在透析液连续流动1min后 用无菌试管接取样本3-4ml,检验方法,倾注法,将洗脱液充分混匀 取洗脱液1.0ml接种平皿 将冷却至40- 45的胰蛋白酶大豆琼脂 每皿倾注15-20ml 35- 37孵育48h 48h后若呈阴性 延时培养至72h 计数平板上的菌落数,菌落总数(cfu/ml）=平板上的菌落数,结果计算,无菌操作取100ul样本 滴于培养皿表面 均匀涂抹 35- 37孵育48h 48h后若呈阴性 延时培养至72h 计数平板上的菌落数,涂抹法,菌落总数(cfu/ml）=平板上的菌落数10,结果计算,透析用水细菌总数,合格标准,ISO 13959:2002 血液透析和相关治疗用水,200cfu/ml,100cfu/ml,口腔科治疗用水的细菌菌落总数应100cfu/mL,口腔科治疗用水的细菌学监测,直接取治疗用水1mL接种平皿 37恒温箱培养48h 计数细菌菌落数。,检测方法,合格标准,血液透析用水内毒素监测 最初每周监测1次 连续2次检测结果符合要求后 应至少每3月送检1次,国际标准ISO 13959:血液透析和相关治疗用水,水处理输出端内毒素含量应 1EU/ml 血液透析器入口的输出点内毒素含量5EU/ml,样本,反渗水 透析液,采集方法,容器 专用无热源真空管,方法 用75%酒精擦拭采样口 酒精自然风干后打开采样口 1分钟后用无菌无热源注射器针头 深入采样口内 吸取样本3-4ml,用75%酒精消毒无热源真空管顶端 待酒精自然挥发后 将样品注入真空管内 （不可打开真空管上方的红色盖子）,实验方法,动态比浊法（仪器法）,注意事项,样本采集、保存、运送整个过程中 避免外来热源的污染,采样管抽真空 以防管内压力过高试管盖崩掉,运输过程中做好保护措施 以免运输途中碰撞、破碎,每次送样时需同时送3支与采样时所用的 同一厂家、型号、批号的注射器,存在的问题,采样管的选择,送样点,运输,普通注射用水0.25EU/ml 内毒素监测用水0.003EU/ml,谢谢,产品资料： 注：图片及文字介绍仅供参考，请以实物为准 简介： 我厂生产的 六级筛孔撞击式空气微生物采样器，是一种双功能阶式多级撞击采样器，可广泛地用于卫生防疫、生物洁净、制药、发酵工业等环境中的监测以及有关研究教学部门作空气微生物的采样研究，为评价空气环境微生物污染危害及其防治措施提供依据。 特点： 六级筛孔撞击式空气微生物采样器能够测定空气微生物的数量之外，它独有的特性是还能