伪狂犬病毒PCR诊断.ppt

实验九 伪狂犬病毒PCR诊断,实验目的：,1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤； 2、掌握伪狂犬病毒PCR检测的方法；,实验内容：,1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤， 让同学们观看PCR反应的动画； 2、伪狂犬病毒PCR检测。,什么是PCR？,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。,一、PCR反应的原理、方法及操作步骤,PCR及有关技术的发展历史（1）,1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim),PCR及有关技术的发展历史（2）,1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ）于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。,PCR及有关技术的发展历史（3）,1992 年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利； Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。,PCR及有关技术的发展历史（4）,九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查,PCR原理,PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法， 其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。,PCR原理,PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环 （2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增 。,（1）DNA模板的热变性 将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。 （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。,（3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。 以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环 ，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。,PCR原理,Sample denaturatation Primer annealing Primer extension,PCR product,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,2. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA -cDNA-PCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性 52退火72延伸循环30次过程中不变性失活。,逆转录,酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,引物设计的原则（一）,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 引物的有效长度不能大于 38 bpmer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72），不能保证PCR扩增产物的特异性 引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,引物设计的原则（二）,避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 引物 3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处,引物设计的原则（三）,引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量： 每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好. 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会.,引物在线设计网址：,/cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi,dNTP 的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,PCR反应条件的选择,PCR反应条件: 温度 时间 循环次数,温度与时间的设置：,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸, 变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,引物的复性温度 通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T） 复性温度=Tm值-（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。, 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,（6）参数 变性温度与时间 一般选择： 940C， 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 一般选择： Tm - 5 延伸温度与时间 一般选择： 70 75 循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次,PCR反应特点,特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低,PCR产物分析 凝胶