现代分子诊断技术.ppt

第七章 现代分子诊断技术,酶联免疫吸附测定 DNA诊断系统 DNA指纹 遗传性疾病的分子诊断技术,基因诊断,基因,蛋白质,性状,生化诊断,基因诊断,临床诊断,传统的诊断程序 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异 诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒,检测寄生虫感染的诊断方法的比较,现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应 2、灵敏度(sensitivity)高 3、操作简单(simplicity),基因诊断的特点,特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素 灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平 稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态 诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 临床应用前景好,基因诊断优点,从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 显著提早产前诊断的时间 无需对组织、器官或细胞进行选择 快捷准确、安全,基因诊断常用的技术,核酸分子杂交 PCR（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析 SSCP（单链构象多态性分析） DNA 测序 DNA 芯片技术,DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays Protein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray,Southern blot,N,N T T N T T,FISH,PCR技术,DNA测序,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术,DNA芯片技术的概念,DNA芯片技术原理,大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,DNA芯片技术流程,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis,基因诊断的原理,利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法 策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因,基因治疗的机理,基因置换：正常基因取代致病基因 基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列 基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能 基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达 基因封闭：封闭特定基因的表达 “自杀基因”的应用 免疫基因的治疗 耐药基因的治疗,美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例,1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。,谢德尔，1999,分子诊断,利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。,分子诊断,遗传性疾病的诊断,羊水和胎盘绒毛膜检测,第一节酶联免疫吸附测定,抗体高度特异地与抗原分子结合 通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA),一、酶联免疫吸附测定的原理,工作原理： 主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合 假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体,二、检测过程： 将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上 加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去 加入二抗（secondary antibody），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去 加入无色底物,双抗体夹心法,检测大分子抗原,间接法,检测抗体,竞争法,测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体,双夹心法,测定大分子抗原,特异性相同，来源不同,3、使用多克隆抗体的缺点 同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异 无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化 单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置,4、酶联免疫吸附测定的局限性 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合,第二节 DNA诊断系统,DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记,一、核酸杂交,1、工作原理： 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键 2、3个关键要素： 探针DNA 目的DNA 信号检测,主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链,碱基互补,核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,3、杂交探针,必须是高度特异性的DNA片段 种级探针：区分两个或多个物种 亚种级探针：区分物种内特定的株系 DNA RNA 化学合成或克隆的完整基因 基因的一个片段,利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类,分离杂交探针的方法： 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 限制性内切酶进行酶解 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选,核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测,4、非同位素标记探针,32P的缺点： 半衰期短，仅13天 操作起来比较危险 必须要有特殊的实验室设备进行操作 放射性垃圾的处理繁琐,非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 检测发光和颜色变化可在几小时内完成,B,B,生物素,加入链霉素抗生物蛋白,加入生物素标记的碱性磷酸酶,探针,目的DNA,加入不同的生色或化学发光底物,荧光标记的引物直接进行PCR检测,DNA,引物1,引物2,荧光染料,PCR,层析,荧光检测,游离引物,分子夹心探针检测,发出荧光,分子夹心探针(没有荧光),荧光团,猝灭剂,目的DNA,与目的DNA杂交,TaqMan探针技术,原理： 利用Taq酶的3 5外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量,3,5,5,3,R,上游引物,下游引物,5 ,3,3,5 ,R,TaqMan探针的荧光信号产生机制,疟疾的分子诊断：,检测是否存在疟原虫 抽取血样进行镜检 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染 DNA杂交诊断,例一：,DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 具体的分离过程： 构建一个疟原虫的核基因文库 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 选出那些杂交信号最强的克隆 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性,锥虫的检测,锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞 显微镜检新鲜血液 取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道 免疫检测:假阳性高,例二：,PCR检测 针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带,二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术,抗生素的不合理使用 DNA杂交 PCR检测 噬菌体介导,DNA杂交,设计16SrRNA为探针 16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性 特异性不是很好 必须结合PCR技术,PCR检测,nested PCR 针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物 每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加,模板,使用外引物，进行第一次PCR扩增,使用内引物，进行第二次PCR扩增,第一次PCR扩增产物,第二次PCR扩增产物,巢式PCR原理示意图,PCR技术也会产生假阳性 新扩增的目的DNA特异性不强 退火温度过低 模板中杂质的污染 假阴性 存在Taq酶的抑制剂 模板量过少 模板DNA纯度不够,原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测 不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位,原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态,有,噬菌体介导细菌检测,将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品 噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生 结核菌的检测 抗药性菌株的检测,荧光素酶,荧光素ATP,荧光,利用宿主细胞转录、翻译,噬菌体基因,荧光素酶基因,宿主细菌,噬菌体介导的细菌检测,第三节 DNA指纹,每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色体中部含有一个DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序,每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA” “小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA “中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹” 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间9999的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”,所罗门的审判：,大家都听说过所罗门的审判这样一件故事： 两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是 所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其 辟成两半分给他们两， 结果假母亲同意所罗 门的判决，而孩子真 正的母亲却恳求侍卫 饶了孩子的性命，她 解释说：“把孩子给了 假母亲，总比让孩子 惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了。,滴骨验亲法：,以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。 三国时代（公园220280年）谢承著会稽先贤传中的以弟血滴兄骨可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。,合血法：,等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”,方法：,DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱 DNA 酶解 电泳 转膜 杂交 最常用的DNA探针是微卫星序列,第四节 遗传性疾病的分子诊断技术,直接诊断 点突变 间接诊断 多态性连锁分析,美国前副总统汉弗莱Humphrey) 在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。,九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。,1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了,P53抑癌基因,遗传性疾病的分子诊断技术,PCR酶解鉴定 PCROLA鉴定 PCR-ELISA检测 PCR-DGGE鉴定 扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS） 连接酶链反应（LCR）,镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia),典型的单基因遗传性疾病 血红蛋白的链（珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val,血红蛋白 -链上 谷氨酸变成缬氨酸,英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。,一、PCR酶解鉴定,正常基因为CCTGAGG 镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGG 限制性内切酶CvnI的识别序列为CC TNAGG,方法: 在CvnI位点的两点设计两个引物; 包含CvnI位点区域的DNA片段通过PCR扩增出来; 扩增的DNA用CvnI酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查DNA带型。,CvuI处理,CvuI,CvuI,CvuI,256bp,201bp,181bp,88bp,CvuI,CvuI,256bp,382bp,88bp,正常情况,镰刀形细胞贫血症,PCR 扩增,引物1,引物2,PCR产物（长726bp）,二、PCR/OLA鉴定,OLA(oligo-nucleotide ligation assay),寡聚核苷酸连接分析 假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说150位的T突变为G 根据150位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的一条链互补,探针X：寡聚核苷酸链的3端最后一个核苷酸正好与正常基因的150位的的核苷酸配对 探针Y：另一段寡聚核苷酸链的5端第一个核苷酸与151位的核苷酸配对,正常基因,150,151,150,151,B,D,双链目的DNA或PCR产物,热变性,单链目的DNA或PCR产物,加探针退火,完全配对,模板有突变,不完全配对,连接酶,连接酶,加入链霉抗生物素蛋白,加入链霉抗生物素蛋白,加入碱性磷酸酶 加入无色底物,加入碱性磷酸酶 加入无色底物,AP,变色,无色底物,有色底物,保持无色,无色底物,PCR/OLA分析程序示意图,例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症,（1）提取DNA，热处理成为单链DNA； （2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链； （3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。,三、PCR-ELISA检测,在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP和其他3种dNTP 3端经DIG标记特异性探针 包被有抗生物素抗体的酶标板 抗碱性磷酸酶（AP）DIG抗体 如果加入的DIG标记的探针可与扩增片段结合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜色的变化,四、PCR-DGGE法,原理 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统 Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少 DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度5060 ，变性剂0100% 当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链,原理 同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成相互分开的条带图谱 不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个高熔点区GC夹，即在一侧引物的5端加上一个3040bp的GC结构，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析,突变型,野生型,杂合型,五、扩增阻滞突变系统,等位基因特异性扩增 原理 Taq缺乏3 5外切酶活性，如果引物的3 端不能与模板DNA严格互补配对，模板DNA 就不能有效的扩增,5 TACATTAGGTT 3,野生型序列,突变序列,野生型引物,突变引物,ARMS原理示意图,野生型DNA,ARMS检测突变体举例,纯合突变体DNA,发绿光,A,T,G 3,引物3,无法扩增没有荧光,B,ARMS检测突变体举例,杂合突变体DNA,G,发黄光,C,ARMS检测突变体举例,T,C,引物1,引物2,G,T,六、连接酶链反应,基本原理 利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增 设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物,第五节 基因工程疫苗,一、疫苗的简介 二、基因工程疫苗 1、亚单位疫苗 2、肽基疫苗 3、DNA疫苗,一、疫苗的简介,Dr Edward Jener（1796）： 用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染 Louis Pasteur （19世纪末）： 研制成功狂犬疫苗 Von Behring Kitasato Shibasaburo： 开发研制白喉/破伤风疫苗,医学上最有潜力的防御物质 灭活的和减毒的致病物质 不能丧失引起免疫反应的能力 麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎,传统疫苗的局限性,有些致病物无法在培养基上生长； 动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养； 培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低； 需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保护措施； 疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全杀死或充分减毒； 减毒菌株有可能发生突变； 有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微； 绝大多数的现行疫苗的有效期短。,衡量疫苗能否投入使用的标准,安全性 删除致病基因，保留抗原性。 有效性 尽可能调动机体细胞免疫和体液免疫。,免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫,抗原,抗原肽,细胞表面复合物,活化的B细胞（浆细胞）,淋巴因子,活化的T细胞,抗体,杀灭抗原分子,抗原显示细胞（如树状细胞）,吞噬，分解,MHC蛋白质,识别、激活,杀伤T细胞,激活释放,激活,分泌,体液免疫,细胞免疫,二、基因工程疫苗 指用基因工程的方法，表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫苗,1、亚单位疫