分子生物学课件第二章DNA的结构.ppt

第二章 染色体与DNA,内容提要,DNA的结构 DNA的二级结构的多态性和动态性 DNA的变性和复性 DNA超螺旋和拓扑异构酶 基因组大小与C值矛盾 原核生物染色体及其基因 真核生物染色体及其基因 DNA的复制 原核和真核生物DNA的复制特点 DNA的修复 DNA的转座,DNA的一级结构：DNA的共价结构和核苷酸顺序。 DNA的二级结构：一定或全部核苷酸序列所形成的规律性结构。 DNA的三级结构：染色体DNA所具有的复杂折叠状态。 DNA结构有多样性，这些多样性的结构还会相互转变，处在动态中。,第一节 DNA的一级结构,脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成为脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自由的5磷酸基团，称5端；另一端核苷酸具有自由的3羟基，称3端。 交替的磷酸和2-脱氧核糖构成分子的骨架，碱基为侧链，碱基类似于蛋白质氨基酸的侧链，影响着所形成的核酸的结构和功能。 碱基的疏水特性 碱基形成氢键的特性,DNA的碱稳定性 DNA对碱相对稳定 RNA在碱性溶液中易降解为2，3环式单核苷酸中间产物，然后很快转变为2 单核苷酸和3单核苷酸。,DNA结构的表示法,DNA一级结构的重要性,携带遗传信息 决定DNA的二级结构 决定DNA的空间结构,第二节 DNA的双螺旋结构,绕DNA双螺旋表面上出现的螺旋槽（沟），宽的沟称为大沟，窄沟称为小沟。大沟，小沟都是由于碱基对堆积和糖-磷酸骨架扭转造成的。,右手双螺旋结构模型的要点：,1 主链: 2 碱基对 3 螺距 4 大沟和小沟,主链是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构，脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架 两条链上的碱基以氢键相连，G与C配对，A与T配对。嘌呤和嘧啶碱基对层叠于双螺旋的内侧,C-G,T-A,8.5 ,11.7 ,7.5 ,5.7 ,Major Groove,Minor Groove,大沟和小沟，特别是大沟，对于在遗传上有重要功能的蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的，只有在沟内，蛋白质才能“感觉”到不同碱基顺序，而在双螺旋结构的表面全是相同的磷酸和脱氧核糖的骨架，没有什么信息可言。,决定双螺旋结构状态的因素 （一）氢键 1 . 碱基的氢供体 氨基、羟基 2. 碱基的氢受体 酮基、亚氨基 3. GC对及AT对之间的氢键 在一定范围内DNA的稳定性与GC百分含量成正比 Tm=69.3+0.41(%G+C),4. 氢键数对DNA双链稳定性的影响 5. 碱基之间形成氢键的条件 互补性 方向性,（二）碱基堆集力 1. 碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力 2. 碱基堆集力的来源 疏水作用 累积的Van der Waal的作用力 3. 碱基堆集作用的证据 单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构 破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性,（三）带电荷的磷酸基的静电斥力 磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。 （四）碱基分子内能 碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定,嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响 碱基组成相同，但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著的差异。从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。 5 TA 3 的Tm值最低。 TATA框：RNA聚合酶的结合位点。 UAA：终止密码子。,第三节 DNA的二级结构的多态性和动态性,右手螺旋：A-DNA，B-DNA 左手螺旋：Z-DNA,B-DNA构象： 相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA以B构象存在。 A-DNA构象： 当相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。 Z-DNA构象： 在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。 Z-DNA的存在与基因的表达调控有关。,B-DNA、A-DNA及Z-DNA结构特征比较 B-DNA A-DNA Z-DNA 每圈bp数 10-10.6 11 12 每bp转角（度） +34.6 +34.7 -30 每bp上升距离（A） 3.38 2.56 3.71 螺旋直径（A） 19 23 18,B-DNA是最常见的DNA构象； A-DNA和Z-DNA可能具有不同的生物活性。现已证明，左手Z-DNA（1979，Rich）只是右手螺旋结构模型的一个补充和发展。,Z-DNA调控基因转录的两个模式,Z-DNA调控基因转录的两个模式,第四节 DNA的双螺旋结构的呼吸作用,双螺旋DNA结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡之中，这种氢键的迅速断裂和再生过程称为DNA链的呼吸作用。 在富含AT的节段，呼吸作用更为明显，常发生瞬间的单链泡状结构，这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读DNA链内部储藏的信息具有重要作用。,作业：,1、 DNA双螺旋模型是哪年、由谁提出的?简述其基本内容。 2、DNA的双螺旋结构有哪几种不同形式，各有何特点？,第五节 DNA的变性和复性,DNA的变性：DNA双链的氢键断裂，逐步变为近似于无规则线团的过程称为变性。 DNA的变性发生在一个狭窄的温度范围内。 增色效应：在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。 吸收值的骤然上升表明DNA的变性是一协同性过程。,融解温度（Melting temperature Tm )：变性过程紫外线吸收值增加的中点的温度称为融解温度。 生理条件下一般为85-95。 影响因素：G+C含量，pH值，离子强度，尿素，甲酰胺等。 计算Tm值的经验公式： 在0.15mol/L NaCl+0.015mol/L柠檬酸钠溶液中，当DNA长链G+C百分含量在30%70%时 Tm = 69.3+0.41（G+C）% 当DNA链长度18nt时，可近似认为 Tm = 4（G+C）+2（A+T）,Effect of Salt on Tm,复性（Renaturation)：热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。 减色效应：随着DNA的复性，260nm紫外线吸收值降低的现象。 （一）复性的条件 1，消除磷酸基的静电斥力； 2，破坏链内氢键 （二）复性的机制 1.随机碰撞 取决于DNA浓度、溶液温度、离子强度等 2.成核作用（nucleation) 3.拉链作用（zippering）,复性的条件： 足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用的盐浓度为0.150.5mol/L的NaCl； 足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，否则配对碱基之间的氢键难以形成；一般使用比Tm值低 2025的温度。,杂交 复性DNA中，如果两条链来源不同，称杂交分子。 重要的杂交技术： Southern Blotting Northern Blotting,形状:双股（ds)线型、环型，单股（ss）环型 大小 真核生物DNA复性动力学 DNA的复杂性（复杂长度）：动力学复杂长度 4.2106bp样品DNAC0t1/2/大肠杆菌DNAC0t1/2 化学复杂长度：用化学方法测量的DNA的长度。 重复频率f=化学复杂长度/动力学复杂长度,第六节 DNA的形状、大小和序列组织,Figure 3.6 The reassociation kinetics of eukaryotic DNA show 3 types of component (indicated by the shaded areas). The arrows identify the Cot1/2 values for each component.,3.2 Eukaryotic genomes have several sequence components,不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等 功能：主要是编码蛋白质。 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101103。 如：rRNA、tRNA 一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用,高度重复序列：拷贝数达到几百个到几百万个。 Alu家族，B1家族 卫星DNA：A T含量很高的简单高度重复序列。,第七节 DNA超螺旋和拓扑异构酶,DNA的高级结构 1） 定义：指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。 2）主要形式：超螺旋结构（正超螺旋和负超螺旋）,线状DNA形成的超螺旋,环状DNA形成的超螺旋,正超螺旋和负超螺旋 （一）形成超螺旋的原因和条件 原因：因某种原因引入了额外的螺旋 条件： A、 DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动； B、 DNA双链上无断裂 L=T+W L：DNA的连接数 T：盘绕数 W：超盘绕数 （二）正超螺旋 （三）负超螺旋,超螺旋的意义 影响DNA高级结构的酶 拓扑异构酶 L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一端可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。,拓扑异构酶 or溴化乙锭,拓扑异构酶 or溴化乙锭,DNA扭曲与双螺 旋相同（拧紧）,DNA扭曲与双螺旋相反（松开）,负超螺旋,松弛DNA,正超螺旋,第八节 基因组大小与C值矛盾,C-值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。,C-值矛盾（C-value paradox)： 形态学的复杂程度（物种的生物复杂性）与C-值大小的不一致，称为C值矛盾（C-值悖理） 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。,The C-value paradox refers to the lack of a correlation between genome size and genetic complexity. We know that genes are much larger than the sequences needed to code for proteins, because exons (coding regions may comprise only a small part of the total length of a gene. This explains why there is much more DNA than is needed to provide reading frames for all the proteins of the organism. Large parts of an interruped gene may not be concerned with coding for protein. And there may also be significant lengths of DNA between genes.,真核细胞DNA序列可被分为3类：,1、不重复序列。 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的10%80%。不重复序列长约7502 000bp，相当于一个结构基因的长度。 蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白、血红蛋白和珠蛋白等都是单拷贝基因。,2、中度重复序列 这类序列的重复次数在101104之间，占总DNA的10%40%。 如小鼠中占20%，果蝇中占15%，各种rRNA、tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因等都属于这一类。,非洲爪蟾这些基因（28S、5.8S、18S）及间隔区组成的单位在DNA链上串联重复约5000次。,在动物卵细胞形成过程中，rDNA（就是可以转录产生rRNA的基因 ）可进行几千次不同比例的复制，产生2106个拷贝，使rDNA占卵细胞DNA的75%，从而使该细胞能积累1012个核糖体，以合成大量蛋白质供细胞分裂之需。,3、高度重复序列卫星DNA,只存在于真核生物中，占基因组的10%60%，由6100个碱基组成，在DNA链上串联重复高达数百万次。 卫星DNA不转录，其功能不详。它们是异染色质（异染色质在间期的复制晚于常染色质）的成份，可能与染色体的稳定性有关。,第九节 原核生物染色体及其基因组,The nucleoid spills out of a lysed E. coli cell in the form of loops of a fiber. Photograph kindly provided by Jack Griffith.,The bacterial genome is a nucleoid with many supercoiled loops,细菌的基因组是一个有许多超螺旋环的核酸,Figure 18.6 The bacterial genome consists of a large number of loops of duplex DNA (in the form of a fiber), each secured at the base to form an independent structural domain.,The bacterial genome is a nucleoid with many supercoiled loops,大肠杆菌的一些DNA结合蛋白,经济有效，不编码序列少，一般无内含子 功能上相关的几个结构基因前后相连，形成操纵子 蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在 RNA基因通常是多拷贝的 各种基因的启动子和操作子部分的DNA序列多种多样，以便与RNA聚合酶及阻遏蛋白发生不同程度的结合，对基因的表达进行精细的调节 重叠基因和基因内基因,原核生物基因,原核生物基因组,原核生物的基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少，如大肠杆菌DNA的相对分子质量仅为4.6106bp，其完全伸展总长约为1.3mm，含4000多个基因。,原核生物基因主要是单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因以多拷贝形式存在； 整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成； 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。,原核细胞DNA特点：,1、结构简炼。 原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有很小一部分控制基因表达的序列不转录。如在X174中不转录部分只占4%左右（217/5386),T4 DNA中占5.1%（282/5577)。,2、存在转录单元 原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成转录单元并转录产生含多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA。,3、有重叠基因。 一些细菌和动物病毒存在重叠基因，同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息。 1973年，Weiner和Weber在研究一种大肠杆菌RNA病毒时发现，有两个基因从同一起点开始翻译，一个在400bp处结束，而在3%的情况下，翻译可一直进行下去直到800bp处碰到双重终止信号时才停止。,1977年，Sanger正式发现了重叠基因： X174感染寄主后共合成9个蛋白质，相对分子质量约2.5105，相当于6 078个核苷酸，而病毒DNA本身只有5 375个核苷酸。 Sanger在弄清X174 DNA的全部核苷酸序列及各个基因的起迄位置和密码数目以后发现，9个基因中有些是重叠的。,真核生物染色体的组成,第十节 真核生物染色体及其基因,端粒，着丝点和DNA复制原点是构成染色体不可缺少的三个要素,组蛋白的一般特性： 进化上的保守性 保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H4 无组织特异性 肽链氨基酸分布的不对称性 H5组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%） 组蛋白的可修饰性,组蛋白的一般特性： 1、进化上的极端保守性 保守程度：H1 H2A、H2B H3 、H4,不同种生物组蛋白的氨基酸组成十分相似。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同，与豌豆序列相比也只有两个氨基酸的差异。,2、无组织特异性 仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。,3、肽链上氨基酸分布的不对称性 碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上，而大部分疏水基团都分布在C端。 碱性的半条链易与DNA的负电荷区结合，而另外半条链与其他组蛋白、非组蛋白结合。,4、组蛋白的修饰作用 如甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。修饰作用只发生在细胞周期的特定时间和组蛋白的特定位点上。 H3、H4的修饰作用较普遍。,5、 H5组蛋白的特殊性： 富含赖氨酸（24%）； 还富含16%丙氨酸、13%丝氨酸、11%精氨酸。,组蛋白的可修饰性,在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。 所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。,非组蛋白,非组蛋白占组蛋白总量的6070%，主要包括酶类、与细胞分裂有关的收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白以及肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白等。 非组蛋白的多样性:非组蛋白种类约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 （1）高速泳动蛋白（HMG）：富含赖AA、精AA、谷AA与天冬AA，与DNA的超螺旋结构有关 （2）DNA结合蛋白：与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质 （3）A24非组蛋白：与H2A差不多大小，呈酸性，含谷AA与天冬AA多，于核小体内，功能不详,核小体(nucleosome),1、定义：用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核心构成的。,2、核小体的结构,核心颗粒、连接区DNA,Limited Micrococcal Nulcease Digestion of Chromatin Generates a 200 bp Ladder,6.8:1,40:1,1000:1,8000:1,DNA double helix,Nucleosome (10 nm fiber),30 nm Fiber,Loops I,Loops II,chromosome,3、染色体的包装,真核生物的基因,不连续基因 外显子，内含子 基因家族与基因簇 基因家族：一组来源相同、结构相似、功能相关的基因。 假基因 串联重复基因 组蛋白基因 rRNA基因 tRNA基因 细胞器基因 线粒体基因，叶绿体基因,基因组很小，大多只有一条染色体 结构简炼 存在转录单元(trnascriptional operon) 多顺反子(polycistron) 有重叠基因（Sanger发现）,X174 D-E-J-F-G-H mRNA 蛋白J、F、G H D E,E.coli 色氨酸操纵子 9个顺反子 9个酶,第十一节原核生物与真核生物基因组结构特点的比较,1、原核生物基因组结构特点,基因内基因 部分重叠基因 一个碱基重叠,2、真核生物基因组结构特点,真核基因组结构庞大 一般远大于原核的 含有大量重复序列 非编码序列多 多于编码序列(9:1) 转录产物为单顺反子 基因不连续性 断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、 外显子(exon),存在大量的顺式作用元件。 启动子、增强子、沉默子等 存在大量的DNA多态性（DNA序列中发生变异面导致的个体间核苷酸序列的差异 端粒结构,作业：,1、简述DNA的C-值以及C-值矛盾（C Value paradox）。 2、简述真核生物染色体上组蛋白的种类，组蛋白修饰的种类及其生物学意义。 （中国科学院2003年硕士研究生入学生物化学与分子生物学试题） 3、比较原核、真核基因组的特点（上海第二军医大硕士研究生入学考试试题）,DNA的复制,生命的遗传是染色体DNA自我复制的结果，主要是通过半保留复制来实现的，是一个以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。 亲代DNA以自身分子为模板来合成新的分子，并分配到两个子细胞中去，完成其遗传信息载体的使命。 DNA分子由两条多核苷酸链组成，两条链上的碱基G与C配对，A与T配对；两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。 DNA的复制包括复制的起始、延伸和终止三个阶段。,DNA Replication DNA replication is semi-conservative, one strand serves as the template for the second strand. Furthermore, DNA replication only occurs at a specific step in the cell cycle. The following table describes the cell cycle for a hypothetical cell with a 24 hr cycle. Stage Activity Duration G1 Growth and increase in cell size 10 hr S DNA synthesis 8 hr G2 Post-DNA synthesis 5 hr M Mitosis 1 hr DNA replication has two requirements that must be met: 1. DNA template 2. Free 3 -OH group,1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。,（一）DNA的半保留复制（semi-conservative replication）,2、实验证据（1958 Meselson 和Stahl ）：,3、DNA半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。,（二）与DNA复制有关的物质,1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA 3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物 4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA ，这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 反应需要有模板的指导 反应需要有3-OH存在 DNA链的合成方向为5 3 ,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要聚合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）, 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3-5 外切 - - + + + 酶活性 功能,引物合成,修复 作用,线粒体DNA 的复制,核DNA 的复制,复制 修复,真核生物中的DNA聚合酶,真核细胞主要有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶（定位于胞核，参与复制引发具53外切酶活性），（定位于核内，参与修复，具53外切酶活性），（定位于线粒体，参与线粒体复制具53和35外切活性），（定位于核内，参与复制，具有35和53外切活性），（定位于核内，参与损伤修复，具有35和53外切活性）。,6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。 例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿3 5移动，而解螺旋酶I、II、III沿5 3移动。,9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）,双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 复制的终止,1、双链的解开,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。 复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。,基本概念：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子 复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉,复制方向和速度：,单起点、双向等速,多起点、双向等速,Electron Microscopy of replicating DNA reveals replicating bubbles. How does one prove bidirectional fork movement?,DNA 的复制,Pulse with radiolabeled nucleotide; chase with cold nucleotide. Then do autoradiography,双链解开、复制起始,大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合,在HU蛋白和ATP的共同作用下,DNA复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链,解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链,2、RNA引物的合成,DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。 引物长度约为几个至10个核苷酸，,DNA的半不连续复制,DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。 在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。,3、DNA链的延伸,在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。,4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 （复制终止）,在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链,5、复制终止,a、终止序列 E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用,b、专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码 通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用,ter,双链环状、型复制、双向等速,（四）DNA复制的其它方式,线性DNA双链的复制 滚环型： 单向复制的特殊方式 如：174的双链环状DNA复制型（RF） T7 DNA的复制 痘病病毒DNA的复制,线性DNA的末端复制的问题,(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体：滚环产生多聚复制子）； (2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )。 (3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（Paramecium）的线性线粒体DNA的复制中就形成了一种交联； (4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）,?,二聚体,3-OH,3-OH,T7噬菌体的末端复制,专一性核酸内切酶,线性DNA 双链的复制 单一起点、单向，如：腺病毒,腺病毒（Adnovirus-2） DNA的复制,腺病毒 DNA 复制起始,长的发夹结构,复制起始复不需引物, 避免5-end shortent,不需RNA引物，在正链3OH上延伸; 只有一个复制叉,滚环复制,D环复制,单向复制的特殊方式 如：动物线粒体DNA,（五）真核生物中DNA的复制特点,真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子 真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 复制元相对较小(40-100kb), 复制速度较慢,大 约5005000bp/min. 真核生物有多种DNA聚合酶。 组蛋白八聚体是以全保守的方式传给子代分子的,真核生物复制起始区 酵母的复制起点称为:自主复制顺序(autonomously replicating sequence,ARS) ARS序列的共同特征：具有一个称为A区的11个A-T碱基对的保守序列。 起始需要起始点识别复合物ORC参与，ORC结合于ARS，它是由6种蛋白质组成的复合物。,真核生物染色体 DNA末端补齐模式,（2） 端粒酶（ Telomerase） 1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling,四膜虫 端粒酶 （ telomerase ）将T2G4 末端重复延伸 游扑虫 Telomerase = RNA CAAAACCCC 链 + 末端结合蛋白 （TBP）,端粒酶逆转录酶 a、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP） b、含约长150NT的RNA，其中含 15 拷贝的CxAy重复序列， 是合成端粒T2G4的模板 c、延长的3-T2G4端（一段cDNA）作为5-端DNA合成的模板,（3） 补齐过程,通过TG链的回折形成 发夹结构（GG氢键） 尺蠖模型 实现端粒酶位置的 调整,or,大肠杆菌染色体DNA的复制调控 ColE1质粒DNA的复制调控 真核细胞DNA的复制调控: 细胞生活水平调控 染色体水平调控 复制子水平调控,（六）基因组复制的调控,作业：,1、请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的。（中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试，8分） 2、名词解释 ：冈崎片段，（华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题，3分） Replicon， semi-conservative replication （武汉大学2003年硕士研究生入学分子生物学试题） 3、原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前导链和冈崎片段 A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、引物酶 （华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题）,DNA的损伤与修复,对于生命状态存在和延续来说，DNA分子要求保持高度的精确性和完整性，细胞中没有哪一种分子可以和它相比。在长期进化中，生物体不仅演化出能纠正偶然的复制错误的系统，而且还存在着能修复环境因素（如射线）和体内化学物质造成的DNA分子的损伤的系统。,DNA的损伤,碱基的脱落 AP位点 碱基（或核苷）的改变 错误碱基 碱基的缺失或插入 嘧碇碱基的二聚化 链的断裂 DNA链的交联 氧自由基对DNA的损伤,DNA的修复,1、错配修复,Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺酸甲基化 甲基化紧随在DNA复制之后进行 根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基,根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图,发现错配碱基,在水解ATP的作用下，MutS， MutL与碱基错配点的DNA双链结合,MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端，,错配碱基位于切口5上游端，,2、碱基切除修复,一些碱基在自发或诱变下会发生脱氨基，然后改变配对性质，造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对,胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶,如果复制发生就会产生一个突变,糖苷水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。,由AP核酸内切酶将受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开,。 DNA连接酶连接,利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸,3、核苷酸切除修复,1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链 4）DNA连接酶将切口补平,识别损伤部位,损伤的两边切除几个核苷酸,DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链,DNA连接酶将切口补平,4 、DNA的直接修复,在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体,甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对,光复活：光敏裂合酶在可见光300nm-600nm下活化而催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。,5、SOS修复,SOS修复的概念：SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多。,RecA蛋白在SOS修复中的作用 RecA蛋白的主要生化活性 重组活性 单链DNA结合活性 蛋白酶活性 RecA蛋白的作用 水解LexA蛋白,LexA蛋白在在SOS修复中的作用,LexA蛋白的作用 是一种阻遏蛋白,结合于SOS系统中各基因的操纵子上,使得这些基因不能产生转录产物,对自身基因的表达也有负向控制作用,但正常细胞中其表达量足以阻遏所有SOS基因的表达 当细胞DNA复制受阻时，LexA蛋白被RecA蛋白触发，发生自身催化的水解作用，SOS系统被激活，lexA基因表达也增加。 DNA复制正常后,RecA蛋白失活,LexA蛋白恢复对SOS系统的阻遏作用,由LexA控制的SOS基因构成一个调控元 LexA控制17个基因,统称din(damage inducible genes)基因,或SOS基因 SOS框：所有SOS基因的操作子都含有20bp的LexA结合位点,称为SOS框(SOS box),作业：,扼要说明细胞中DNA修复系统有哪几种（8分）（中国科学院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题）,DNA的转座,一、转座成分概述 （一）转座成分的发现：50年代初，McClintock通过对玉米遗传现象的精细研究，首先发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分（Controlling elements）。,（二）转座子的概念,基因组上不必借助于同源序列就可移动的DNA片段称为转座子（transposons）或转座元件。转座子的转移过程称为转座。 转座作用涉及到转座子的复制，当一个拷贝插入基因组的新位置，原来位置上仍可保留一个拷贝。因此转座作用并不是转座子由基因组的一处转移到另一处的简单过程。 转座频率和自发突变的频率相似，介于每世代每细胞10-5-10-7之间，转座子的切除频率要低得多，介于每世代每细胞10-6-10-10之间。,（三）原核生物转座子的类型,细菌中的转座成分依组成结构可以分为以下几类：插入序列（insertion sequences)，复合转座子（composite transposons），TnA转座子家族（ TnA family）和可转移噬菌体（transposable phages）。 转座子的结构特征：转座子具有反向末端重复序列以及具有编码转座酶的基因。,插入序列（因其插入使靶点处基因失活而被发现） IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 IS的命名、分布及结构 命名：以IS开头，后加不同数字。 分布：是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分。 ：IS1 表示IS1因子插入在噬菌体基因组内。,复合转座子 复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。,TnA家族 复制转座是TnA家族中迁移的唯一模式，它由巨大的(