蛋白质的生物合成-2.ppt

中心法则,第十章 蛋白质的生物合成,翻译(translation)：以mRNA为模板合成蛋白质的过程。,原料：氨基酸 涉及到细胞内所有种类的RNA和几十种蛋白质因子 能量：ATP和GTP提供。 场所：在核糖体,第十章 蛋白质的生物合成,第一节 蛋白质的合成体系 第二节 蛋白质的生物合成过程 第三节 肽链合成后的折叠与修饰 第四节 蛋白质合成后的定向转运,第一节 蛋白质的合成体系,蛋白质的合成要求100多种大分子物质参与和相互协作，这些大分子物质包括mRNA、许多tRNA、核糖体、多种活化酶和各种蛋白质因子。,mRNA与遗传密码 tRNA 核糖体 辅助因子,一、mRNA与遗传密码,（一）mRNA (messenger RNA),携带DNA的遗传信息，作为模板通过翻译将遗传信息传递给蛋白质，直接决定多肽链中AA的顺序。 mRNA分子中四种不同碱基构成特定顺序决定蛋白质分子中20种AA所构成的序列。,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,PPP,mG -,5,3,蛋白质,mRNA的碱基序列是如何翻译成蛋白质的氨基酸序列？ 遗传密码：DNA（或其转录的mRNA）中的碱基序列和蛋白质序列之间的对应关系。,（二） 遗传密码（genetic code）,1954年物理学家G. Gamov首先对遗传密码进行探讨。 4种核苷酸 构成序列( mRNA) 20种基本aa构成序列(蛋白质) ？ 一对一的对应关系， 42=16， 43=64，足够 1961年Francis Crick及其同事的遗传实验进一步肯定mRNA上相邻三个碱基编码一个氨基酸， 此三联体碱基称为密码子（codon）。,遗传密码的发现 1961年，M.Nirenberg等人提出。 43 =64 大肠杆菌中，以多聚U做为mRNA，即polyU+20种放射性同位素标记的氨基酸，大肠杆菌合成体系，在外界环境合适下，合成了一条多聚苯丙氨酸（phe）肽链。 UUU为phe的三联体密码。 确立了polyA为Lys, polyC为Pro等。 发现具有密码子功能的最短链为三个核苷酸，并且含3 -OH和5 -磷酸基的三核苷酸最有效。 阅读方向为5-3 。至1966年，20中氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部破译。全部被查清。,遗 传 密 码,阅读方向为5-3,2、遗传密码的特点,密码子的方向性 密码子的阅读方向及它们在mRNA由起始信号 到终止信号的排列方向均为5-3，与mRNA链 合成时延伸方向相同。,从正确起点开始至终止信号，密码子的排列是连续的。既不存在间隔（无标点），也无重叠。在mRNA分子上插入或删去一个碱基，会使该点以后的读码发生错误，称为移码，由这种情况引起的突变称为移码突变。（RNA的编辑）,（）密码子的读码连续性（无标点，不重叠）,aa1 aa2 aa3 aa4,密码子的简并性:指大多数氨基酸都是由几个不同的密码子编码的现象如UCU，UCC，UCA，UCG，AGU及AGC 6个密码子都编码丝氨酸。 同义密码子（synonymous codon）：编码相同氨基酸的密码子。 只有Met(AUG)和Trp(UGG)仅有一个密码子 。,（3）密码子简并性（degeneracy）,一是可以减少有害的突变。 假如每种氨基酸只有一个密码子，那么剩下的44个密码子都成了终止密码子，一旦某氨基酸的密码子发生单碱基的点突变，则很可能造成肽链合成的过早终止。 二是既使DNA上碱基组成有变化，仍可保持由此DNA编码的多肽链上氨基酸序列不变。如GCN编码Ala，由于简并性的存在，不论第三位的N(A/G/C/U)变成什么，都仍然编码Ala,简并性的生物学意义？,如丙氨酸：GCU，GCC，GCA，GCG，只第三位不同 ，显然密码子的专一性基本取决于前两位碱基，第三位碱基有较大灵活性。发现tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码的摆动性或变偶性（wobble）。 IA、U、C配对。,（4） 密码子的变偶性（摆动性）,密码子阅读时的摆动性,(5) 起始密码子和终止密码子,64个密码子中，有1个密码子AUG既是甲硫氨酸的密码子，又是肽链合成的起始密码子（initiation codon）。 另外3个密码子UAG，UAA，UGA不编码任何氨基酸，而是多肽合成的终止密码子（termination codon）。,密码子在高等、低等生物中基本是完全通用的。 但有例外情况， 如哺乳动物的线粒体中，UGA不再是终止密码子，而编码色氨酸；AGA、AGG为终止密码，而不编码精氨酸。 支原体中UGA不作终止密码，而是编码色氨酸。 原生动物鞭毛虫把终止密码子UAA和UAG 读成谷氨酰胺,（6）密码子的基本通用性,二、tRNA （transfer RNA）,在蛋白质合成中，氨基酸本身不能识别mRNA上的密码子，它需要由特异的tRNA分子携带到核糖体上并由tRNA上的反密码子去识别在mRNA上的密码子。 位于tRNA的反密码子环上，由3个特定的碱基组成，称为反密码子（anticodon）,tRNA是多肽链和mRNA之间的接合器。,tRNA的几个关键部位,一个是氨基酸结合部位：3端CCAOH 另一个是与mRNA的结合部位： 反密码子部位,识别氨酰tRNA合成酶的位点 核糖体识别位点,在蛋白质合成过程中,根据功能将分成三类: 起始tRNA 延伸tRNA 校正tRNA,tRNA分子的突变与校正基因（RNA再编辑）,基因突变,tRNA突变,氨基酸羧基与tRNA3末端腺苷的核糖3-OH连接，形成氨酰-tRNA（由特异的氨酰-tRNA合成酶催化）。 同功受体tRNA（isoaccepting tRNA）：携带相同氨基酸而反密码子不同的一组tRNA（大多数氨基酸都有几种tRNA运载） 在书写时，将所运氨基酸写在tRNA的右上角，如tRNAAla及tRNAcys分别表示转运Ala和cys的tRNA 一种氨酰-tRNA合成酶可以识别一组同功受体tRNA。,3末端的氨基酸 结合部位,是蛋白质合成的场所。 标记各种aa，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，证实蛋白质的合成是在核糖体上进行的。 真核生物：游离核糖体或与内质网结合 原核生物：游离核糖体或与mRNA结合成串状的多核糖体(提高翻译效率)。,三、 核糖体,核糖体是由核糖核酸（rRNA）和几十种蛋白质分子（核糖体蛋白）组成的一个巨大的复合体。 每个核糖体是由大小两个亚基组成，每个亚基都有自己不同的rRNA和蛋白质分子,1、核糖体的组成,大肠杆菌中30S的亚基能单独与mRNA结合成30S核糖体-mRNA复合体，后者与tRNA可以专一性结合(起始AA进入)。50S亚基不能单独与 mRNA结合，但可以非专一地与tRNA结合。 核糖体上有两个tRNA结合位点（主要占据大亚基）：氨酰基位点-A；肽酰基位点-P。还有一个GTP结合位点。,2. E.Coli核糖体存在两个重要的tRNA的结合部位 P位和A位，二者紧密连接，各占一个密码子的距离。 P：结合起始的氨酰-tRNA和肽基-tRNA， A：结合新掺入的氨酰- tRNA。,P,A,5,3,四、辅助因子,蛋白质的合成除了需要mRNA、tRNA、核糖体外，在起始、延伸和终止阶段还需要一系列蛋白辅助因子即起始因子（initiation factor）、延伸因子（elongation factor）释放因子（release factor）等的参与。,蛋白质生物合成所需的辅助因子,第二节 蛋白质的生物 合成过程,原核生物蛋白质的生物合成过程 真核生物蛋白质的生物合成特点 蛋白质合成的抑制剂,氨基酸的活化 多肽链合成的起始 多肽链的延伸 多肽链合成的终止与释放,一、原核生物蛋白质的 生物合成过程（大肠杆菌）,游离氨基酸掺入多肽链以前必须活化即氨基酸与特异tRNA形成氨酰-tRNA,在胞液中进行。 氨基酸的活化由氨酰tRNA合成酶催化。 每一种氨酰tRNA合成酶既能识别自己的配体氨基酸，又能识别对应的tRNA。,1、氨基酸的活化,第一步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E AMP PPi,第二步反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,2-OH连接AA，影响下一步 肽键形成,氨基酸活化的总反应式是：,氨基酸+ATP+tRNA +H2O 氨酰-tRNA+AMP+PPi 20种氨基酸中每一种都有各自特异的氨酰-tRNA合成酶。氨酰-tRNA合成酶具有高度的专一性，它既能识别相应的氨基酸（L-构型），又能识别与此氨基酸相对应的一个或多个tRNA 分子；即使AA识别出现错误，此酶具有水解功能，可以将其水解掉。这种高度的专一性保证了氨基酸与其特定的tRNA准确匹配，从而使蛋白质的合成具有一定的保真性。,氨酰-tRNA 合成酶,氨酰-tRNA合成酶和之相对应的tRNA分子被称为遗传密码第二,tRNA与多肽合成的有关位点,3端-CCA上AA接受位点 识别氨酰-tRNA合成酶位点 核糖体识别位点 反密码子位点（识别mRNA上的密码子）,2、肽链合成的起始 起始密码子的识别： （30S复合物形成） 起始AUG一般位于距5 端25个核苷酸以后，并在其上游（5 端）约10个核苷酸处有一段富含嘌呤的序列（SD序列），原核生物核糖体30S小亚基上的16SrRNA3端富含嘧啶的序列能与之互补配对，这样30S亚基能与mRNA结合(IF3参加，识别起始密码子AUG,使上次循环中的大小亚基分离），在IF1IF参与下，30S-mRNA-IF3进一步与fMet-tRNAi、GTP结合，形成30S复合物：30S-mRNA- fMet-tRNAi (tRNAifMet),5,3 ,AUG,AUG,AUG,现在已经知道作为多肽合成起始信号的密码子有两个，即甲硫氨酸的密码子(AUG)和缬氨酸的密码子(GUG)(极少出现)。在大肠杆菌中, 起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸。,fMet-tRNAi的形成,原核生物核糖体30S小亚基上的16SrRNA3端富含嘧啶的序列能与SD序列互补配对，这样30S亚基能与mRNA结合 并且在mRNA上结合的位置正使30S亚基上的P位对准起始密码子AUG，以便使fMet-tRNAif Met进入P位。,IF-2促进fMet-tRNAifMet进入P位点与核糖体30S亚基结合，从而形成30S起始复合物，此时起始密码子AUG可与fMet-tRNAifMet上的反密码子配对。 GTP水解释放能量促使大亚基结合，形成70S起始复合物 ， IF-1、IF-2和IF-3释放。,IF-1起促进IF-2和IF-3的活性的作用,30S起始复合物,消炎药：链霉素、新霉素、卡那霉素与原核细胞30S核糖体结合，阻止50S核糖体亚基与之结合，从而抑制其蛋白质合成。,蛋白质合成抑制剂,3、多肽链的延伸,分三步进行,(1) 进位,所有氨酰-tRNA必须与EF-Tu-GTP结合才可进入70S核糖体，除了fMet-tRNAi,在大亚基上肽酰转移酶（23SrRNA）（peptidyl transferase）的作用下，A位点氨基酸的-NH2亲核攻击P位点氨基酸的-COOH并形成肽键， P位点tRNA卸载，结果A位点tRNA上携带一个二肽。 核糖体的自身催化完成了肽键的形成！,（2）转肽,嘌呤霉素（与AMP相似）与AA反应生成氨酰嘌呤霉素，容易从核糖体上脱落，中断蛋白质的合成反应。,在EF-G（移位酶或移位因子）的作用下，核糖体沿mRNA5 3方向移动一个密码子的距离，使原来在A上的肽酰-tRNA移到了P位点，原来在P位点的无负载的tRNA离开核糖体，同时一个新的密码子进入空的A位， EF-G 催化的移位过程需水解GTP提供能量。,（3）移位,GTP (TuTs),GTP （EF-G）,三步为一个延伸循环，肽链每掺入一个氨基酸就重复一次延伸循环，消耗2个GTP，肽链合成从N-C,GTP,GDP,Pi,核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,TuTs循环,GTP (TuTs),GTP （EF-G）,三步为一个延伸循环，肽链每掺入一个氨基酸就重复一次延伸循环，肽链合成从N-C,每添加一个氨基酸需消耗4个高能键,回 顾,当终止密码子出现在A位时，终止因子结合在A位，肽链合成终止。,终止因子的结合使肽酰转移酶活性变为水解酶活性，肽基不转移给A位tRNA，而转移给H2O，并把已合成的多肽链从核糖体和tRNA上释放出来。,4、多肽链合成的终止与释放,肽链合成的终止及释放,（1）释放因子RF1或RF2进入核糖体A位。 （2）多肽链的释放 （3）70S核糖体解离,RF,整个过程需要消耗GTP,蛋白质的合成是一个高耗能过程 AA活化 2个高能磷酸键（ATP） 肽链起始 1个（70S复合物形成，GTP） 进位 1个（GTP） 移位 1个（GTP） 终止 1个GTPGDP,第一个氨基酸加入需消耗3个（活化2+起始1 ） 以后每加入一个AA（形成一个肽键）需要消耗4个（活化2 +进位 1个 +移位1个）。 终止 GTPGDP 消耗1个,例：合成200个a.a残基的多肽：,8+1984=800, 氨基酸与tRNA的特异性结合依靠氨酰tRNA合成酶的特异识别作用。 密码子与反密码子特异结合，依靠互补碱基配对结合实现，也有赖于核糖体的构象正常而实现正常的装配功能。,保证准确翻译的关键是什么？,种瓜得瓜种豆得豆的生化机制?,二、真核生物蛋白质的生物合成,核糖体更大，80S 40S+60S 起始tRNA和氨基酸 起始氨基酸为甲硫氨酸，而不是甲酰甲硫氨酸，起始氨酰-tRNA为tRNAiMet 起始密码子为AUG，它的上游5端无富含嘌呤序列（SD），一般在mRNA5-末端的AUG为起点。真核生物mRNA通常只有一个AUG密码子，每种mRNA只转译出一种多肽。 对抑制剂敏感性不同，如亚胺环己酮只作用于80S核糖体，只抑制真核生物的翻译,白喉毒素与eEF2结合，抑制肽链移位。 真核中涉及的蛋白因子较多，有约13种起始因子、两种延伸因子(eEF-l/ eEF-2)、一种终止因子被称为信号释放因子（eRF）。 蛋白质激酶参与真核生物蛋白质合成的调节。 真核中线粒体、叶绿体能进行蛋白质合成，其抑制剂与原核相似。,三、蛋白质合成的抑制剂,第三节 肽链合成后的折叠与修饰,一、多肽链的折叠 二、多肽链的修饰 翻译后的加工使蛋白质组成更加 多样化，使得蛋白质在结构上呈现 更大的复杂化。,多肽链的折叠新生肽链在细胞内特定的部位，在多种蛋白质的帮助下卷曲成正确构象. 肽链的折叠从核糖体出现新生的多肽链即可开始。至少有两类因子参与折叠： 酶： 二硫键异构酶加速蛋白质正确二硫键的形成 肽基脯氨酸异构酶 加速脯氨酸亚氨基肽键的顺-反异构化 分子伴侣,一、多肽链的折叠,分子伴侣(molecular chaperon )：由若干在结构上不相关的蛋白质家族组成，具有共同的功能，在细胞内帮助其他多肽链的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质在执行功能时的结构组分。,1.热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、 HSP60 、HSP40和GreE族 2.伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用: 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP和多肽片段依次结合、解离的循环。,伴侣素的主要作用为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,二、多肽链的修饰,多肽链的修饰可以在肽链折叠前、折叠期间或折叠后进行，也可以在肽链延伸期间或终止后进行。 有些修饰对多肽链的正确折叠是重要的，有些修饰与蛋白质在细胞内的转移或分泌有关。,1、N末端的(甲酰)甲硫氨酸的切除. 在去甲酰酶催化下将肽链合成的起始氨基酸-甲酰甲硫氨酸水解脱掉甲酰基，以便肽链形成所需的构象. 在氨肽酶催化下切去N末端一个或几个氨基酸（包括信号肽的切除） 2、氨基酸侧链的修饰 脯氨酸、赖氨酸侧链发生羟基化作用。 苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸羟基磷酸化。如糖原磷酸化酶。 糖基化作用使蛋白质多肽链转变成糖蛋白（N-糖苷键和O-糖苷键）。,3、二硫键的形成 两个半胱氨酸-SH氧化,4、多肽链的水解断裂 许多具有一定功能的蛋白质如酶、激素蛋白，在体内常以无活性的前体肽的形式产生，这些前体在一定情况下经体内蛋白酶的水解切去部分肽段，才能变成有活性的蛋白质，如胰岛素原变成胰岛素，胰蛋白酶原变为胰蛋白酶等。,5、加辅基 结合上辅基（酶）才具生物活性，如乙酰辅酶A羧化酶与生物素的结合。,胰岛素原的加工,切除C肽后，形成成熟的胰岛素分子,切除信号肽后折叠成稳定构象的胰岛素原,C肽分子内伴侣,第四节 蛋白质定位,翻译转运同步机制（共翻译转移）-分泌蛋白 信号肽假说 分泌蛋白质转运机制 翻译后转运机制（翻译后转移）-线粒体与叶绿体蛋白 蛋白质向线粒体的定位机制,第四节 蛋白质合成后的定向转运,分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。需要在内质网腔中进行初步加工。 首先在游离核糖体上合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后（信号肽切除、二硫键形成、初步糖基化、呈现一定空间结构等）。 部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后（主要发生糖基化）被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。,（一）翻译转运同步机制 （cotranslational transfer）,信号肽是Gunter Blobel1975年提出的，用以解释多肽向内质网的跨膜转运。 信号肽通常在被转运的多肽链的N端，长度为1040个氨基酸残基不等，氨基端至少含有一个带正电荷的氨基酸，序列中心为含有10 15高度疏水的氨基酸（对跨膜很重要）残基，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。 新生肽的命运就取决于信号肽和其他的信号序列。 信号肽的C末端有一个可被信号肽酶识别的位点，当蛋白质进入内质网腔后，信号肽即被信号肽酶切去。,信号肽假说,当包含信号肽的多肽被合成一部分时，信号肽识别体（SRP）就识别信号肽并结合到核糖体上，翻译暂时停止，SRP与内质网膜上的受体（停泊蛋白）结合，核糖体与内质网结合，SRP离开，新生肽链恢复延长，延伸的肽链在信号肽的引导下，穿过由转运蛋白在内质网膜上形成的孔进入腔中，进行初步的翻译后修饰（信号肽被切除）。,含信号肽的多肽进入内质网的过程：,被转运到内质网中的多肽多数还要运往它处。经过初步的翻译后修饰，可溶性蛋白和膜结合蛋白被运输到高尔基体，这种运输是经过运输泡进行的 在高尔基体中，多肽进一步被修饰，如N-糖苷键型寡糖链进一步被处理，特定Ser和Thr残基进行O-糖苷键型糖基化修饰。最后将蛋白以囊泡的形式运往溶酶体或运到质膜或分泌到胞外。,高尔基体将各种蛋白 进行分类,（二）翻译后转运机制（posttranslational translocation）,叶绿体蛋白和线粒体蛋白。 在细胞质游离核糖体上被完全合成后通过新生肽的信号序列（引导肽Leader peptide）直接运往目的地并被加工。,线粒体外膜,线粒体内膜,带有导肽的线粒体蛋白质前体跨膜运送过程示意图,内外膜接触位点的蛋白质通道,线粒体hsp70,受体蛋白,hsp70,导肽,蛋白酶切除导肽,结 束,70S复合物的形成：,+ 50S核糖体,P位点,A位点,GDP+Pi、IF1、IF2,肽链合成的起始,30S亚基 mRNA IF3- IF1复合物,30S mRNA GTP- fMet tRNA- IF2- IF1复合物,70S起始复合物,mRNA +30S亚基-IF3,IF-1,70S起始复合物,三、肽链的延伸