生物化学蛋白质之三.ppt

蛋白质化学之三 蛋白质结构与功能的关系,主讲教师：张丽霞,大庆师范学院生命科学学院,2.4 蛋白质结构与功能的关系 一、蛋白质一级结构与功能的关系 二、 蛋白质的空间结构与功能的关系 2.5 蛋白质的性质与分离、纯化技术 一、蛋白质的性质 二、 蛋白质的分离纯化技术,目 录,小 结,习 题,目的与要求,1.充分理解蛋白质结构与功能的关系:包括一级结构与空间构象的关系；蛋白质空间结构与生物学功能的关系。 2.掌握蛋白质的理化性质：胶体性质、两性电离与等电点、沉淀作用、变性作用以及这些性质的生理意义及实践意义。 3.了解蛋白质分离提纯的常用方法及基本原理。,（一）、一级结构的变异与分子病,分子病（molecular disease）：由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变，从而导致蛋白质功能障碍的疾病。 【经典举例】镰形细胞贫血症：编码珠蛋白链的结构基因第六个密码子由CTTCAT，相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由GluVla；其空间结构发生相应改变，丧失运输氧的生物活性。,一、蛋白质一级结构与功能的关系,2.4 蛋白质结构与功能的关系,（二）、一级结构与种属差异,对比不同机体的同种功能蛋白质，发现其种属差异明显; 亲缘关系越近,其蛋白质结构越相似。,与功能相关的氨基酸是高度保守的，这说明不同种属的生物在进化上来自相同的祖先。不同种属间的同源蛋白质一级结构上的氨基酸残基数差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。,（三）、一级结构的局部断裂与蛋白质激活：,胰岛素原一级结构与激活过程,二、蛋白质空间结构与功能的关系,(一)核糖核酸酶的变性与复性,牛核糖核酸酶的一级结构,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,注意:蛋白质的功能取决于特定的天然构象，而规定其构象的信息包含在它的氨基酸序列中。,（二）血红蛋白的别构效应,血红蛋白的亚基铁卟啉,别构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。,亨廷顿舞蹈病,疯牛病,老年痴呆症,疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一种人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,一级结构,空间结构,功 能,决定,直接体现,注意：蛋白质的结构与功能是高度统一的。,小 结,基础,一、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,2.5 蛋白质的性质与分离、纯化技术,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜,二、蛋白质的胶体性质与沉淀,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质沉淀方法：,盐析： 条件:高浓度的强电解质盐(如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等)-盐析; 低浓度的盐溶液-盐溶。 机理：破坏水化膜，中和表面的净电荷。 注意:盐析法不会使蛋白质产生变性。,2.有机溶剂沉淀法： 条件:有机溶剂如乙醇、丙酮等。 机理：破坏蛋白质的水化膜。 注意:低温条件下进行，否则溶解热会使蛋白质变性。,3.重金属盐沉淀 条件：pH 稍大于pI为宜; 机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 注意:蛋白质变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。,4.生物碱试剂沉淀法 条件：pH稍小于pI;生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。,5.弱酸或弱碱沉淀法： 条件：pH=pI 机理：破坏蛋白质表面净电荷。,三、蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素： 1）物理因素：高温、高压、射线等; 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等。,蛋白质变性后的性质改变： 溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,复性(renaturation),天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,* 蛋白质变性易沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,四、蛋白质的紫外吸收,五、蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,（一）分离纯化蛋白质的意义,研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高,不变性； 提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态； 作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。,（二）蛋白质分离纯化的一般步骤,材料的选择原料的预处理蛋白质的抽提从抽提液中沉淀蛋白质纯化蛋白质的结晶,六、蛋白质的分离纯化,1.原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，容易收集，新鲜无腐败。 2.原料的预处理：胞外蛋白质，材料破碎后，用适当的溶剂直接抽提；胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。 3.从抽提液中沉淀蛋白质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。,4. 纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。 方法：透析或超滤、电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、超速离心法等。 5. 蛋白质的结晶：从溶液中重新沉淀蛋白质。,（三）蛋白质的分离和纯化方法,1.透析及超滤法,* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,*使用丙酮沉淀时，必须在0-4低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,2.丙酮沉淀与盐析,3.电泳(elctrophoresis),电泳是带电的颗粒在电场中定向移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳技术 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液由（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,（四）层析,蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。,小 结,1.蛋白质分类：A：按分子形状分；B：按生物学功能分； 2.蛋白质的结构可分为4个层次：一级结构是指多肽链通过肽键共价连接的氨基酸序列。蛋白质主链的折叠形成由氢键维系的重复性结构称为二级结构，最常见的二级结构有螺旋、折叠片、转角和无规则卷曲。三级结构是指由二级结构元件构成的整个多肽链的三维构象，包括相距甚远的肽段间和侧链基团间的相互关系。蛋白质的四级结构是指聚集两条或更多具有三级结构的多肽链（亚基）空间配置形成的构象。,3.天然蛋白质分子受某些物理因素或化学因素的影响，物理化学性质改变，生物活性丧失的现象称为蛋白质变性，变性的实质是分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体，而蛋白质一级结构保持不变。 4.蛋白质的生物功能取决于它的构象，构象是由氨基酸序列决定的。 5.导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病。,6.蛋白质可采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤法等进行测定。 7.蛋白质的某些颜色反应，如双缩脲反应和酚试剂反应，可用于定性或定量检测。根据蛋白质溶解度不同可以分离蛋白质，如盐析、等电点沉淀法和低温有机溶剂沉淀等；根据蛋白质分子大小进行分离的方法有透析、超滤和凝胶过滤法；根据蛋白质带电性质进行分离的方法有电泳法和离子交换层析法。,小 结 1.重要名词：isoelectric point；domain; subunit；allosteric effect; protein denaturation; m