课件：铁罗汉对肠道菌群的影响研究.ppt

,铁罗汉对肠道菌群的影响研究,一、铁罗汉简介 四大名枞之一，香气浓郁清长，有铁罗汉独特香气，岩韵显；味醇厚，具有爽口回甘的特征；汤色浓艳，呈橙红色；叶底肥软，绿叶红镶边。乌龙茶，原为武夷茶树名。原生长在慧苑岩内鬼洞中，树型壮实，叶长。治病有奇效。,【产地】铁罗汉茶，武夷四大名枞之一。茶树无性系，小乔木型，中叶类，晚生种，原产福建武夷山慧苑岩。铁罗汉茶产量高适制武夷岩茶（乌龙茶），品质优良亦适制红茶和绿茶。茶树抗寒性较强，适宜在福建武夷山茶区种植,茶道。,【工艺】铁罗汉茶采制技术精细，每年春天，采摘3-4叶开面新梢，经晒青、凉青、做青、炒青、初揉、复炒、复揉、走水焙、簸拣、摊凉、拣剔、复焙、再簸拣、补火而制成。,【特征】成品铁罗汉茶香气浓郁，滋味醇厚，有明显“岩韵”特征，饮后齿颊留香，经久不退，冲泡9次犹存原铁罗汉的桂花香真味，被誉为“武夷铁罗汉王”。在闽南以及东南亚拥有众多的爱好者。,二、功能及成分分析,2019,-,3,三、肠道菌群的介绍,2019,-,4,四、铁罗汉对肠道菌群的影响研究,2019,-,5,1、医药保健,来源：毛茛科铁罗汉，以根入药,性味归经：辛，温。有大毒。,功能主治：祛风除湿，活血通络，止痛。用于局部麻醉，风湿麻木，腰腿疼痛，关节扭伤。,用法用量：一般泡酒外搽,2019,-,6,2、疗效作用,2019,-,7,3、药用成分,2019,-,8,3、药用成分,2019,-,9,1、肠道菌群主要细菌的作用,2019,-,10,2、人体微生态系统,2019,-,11,3、肠粘膜屏障,正常菌丛（益生菌） 与肠道致病菌竞争机制 占领空间，竞争必需营养与上皮附着点 制造抗微生物成份，挥发性脂肪酸，修饰胆酸，不利致病菌生长环境 诱导免疫细胞汇集，激活适当的免疫与炎症反应,2019,-,12,4、肠道菌群平衡,2019,-,13,6、腹泻产生的原因,在观察肠炎、菌痢与肠道菌群的变化时： 致病菌定植、需氧菌、肠杆菌数明显增加, 而拟杆菌、双歧杆菌等厌氧菌数减少, 其比例也改变。平衡破坏, 肠功能紊乱。会引起肠 道菌群的改变 ,包括菌群种 类、数量、比例等变 化，这种变化既反映了生态平衡失调,也反应出肠菌群对致病菌的拮抗作用。体外实验研究 证 实:肠 球 菌、双歧杆菌 、拟杆菌等对致病菌如志贺氏菌有 明显 的 拮抗作用。,肠道正常菌群在维持肠道正常结构和功能上起重要作用,腹泻时寄主 的肠道菌群的生态平衡失调,作为生态防治方法,其目的就在于调整和恢复生态平衡,故其用于腹泻的治疗是很有前途的。,2019,-,14,5、肠道菌群分布,肠道菌群,近端小肠的菌丛与胃内相近，但常能分离出大肠杆菌和厌氧菌。,远段回肠，厌氧菌的数量开始超过需氧菌，其中大肠杆菌恒定存在，厌氧菌如类杆菌属、双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属，都有相当数量。,在回盲瓣的远侧，细菌浓度急剧上升，结肠细菌浓度高达10.11 10.12 CFU/ml，细菌总量几乎占粪便干重的1/3。其中厌氧菌达需氧菌的10.3 10.4 倍。主要菌种为粪杆菌属、双岐杆菌属和真杆菌属,从口腔进入胃的细菌绝大多数被胃酸杀灭，剩下的主要是革兰氏阳性需氧菌。,小肠菌全的构成介于胃和结肠之间。近端小肠的菌丛与胃内相近，但常能分离出大肠杆菌和厌氧菌。在远段回肠，厌氧之间。,2019,-,15,1、研究的背景、目的、意义,背景：历史上闽南惠安县有个叫施大成的商人开了个施集泉铁罗汉店，在19世纪中叶经营武夷岩铁罗汉，以“铁罗汉”最为有名。 在1890年-1931年前后惠安县虽发生两次时疫，患者用施集泉的铁罗汉后，得以痊愈，因有如罗汉菩萨救人济世，故得名 清代周亮工闽铁罗汉曲云：“雨前虽好但嫌新，火气未除莫接唇，藏得深红三倍价，家家卖弄隔年陈。” 连横(雅堂文集)亦云： “新铁罗汉滑而无骨，旧铁罗汉浓而少芬，必新旧合拼，色味得宜，嗅之而香，吸之而甘，虽历数时，芳流齿颊，方为上品。” “铁罗汉”正是采用久藏五至十年的武夷山慧苑岩铁罗汉叶，配以少量的新铁罗汉，加以传统秘方精制而成。不仅具有岩铁罗汉之韵，蕴兰桂之芳，且有提神醒脑、祛火消食、解呕止泻、减肥美容诸功能 南洋家居必备常用药，可用于治疗晕船时呕吐的症状，对于腹泻药效可嘉 目的：此次研究是对铁罗汉在治疗痢疾（解呕止泄）等发挥药效的原因进行探究，研究饮用铁罗汉是否能改善肠道菌群的作用？是否有利于有益菌群生长，改善肠道菌群分布，从而达到治疗效果。 意义：通过此次的研究成果，进一步挖掘铁罗汉的药用价值，找出其主要影响成分或作用机理，实现对人体的健康保健。,2019,-,16,2、对研究的猜想,铁罗汉中的某种成分对于肠道菌群失调时能起到使其恢复生态平衡的状态，因此对于治疗痢疾，腹泻等肠道疾病有着良好的效果，而由文献查得低聚果糖对于人体肠道菌群的调整作用甚佳，尤其能促进双歧杆菌的增殖，而铁罗汉中也有低聚果糖，这对后面的实验提供了研究的方向，当然，这只是一种猜想，还需要实验结果的检验！,2019,-,17,3、研究方法,腹泻模型的制备,首先验证丙三醇(甘油)能否导致腹泻,再研究导致腹泻的甘油的量和腹泻时间,顺便观察一下小鼠腹泻的伴随症状 注意观察甘油除致腹泻外是否还有其它副作用,如致死,掌握用灌胃器向小鼠胃灌甘油的技巧,2019,-,18,小鼠灌胃方法,灌胃针从嘴角处插入口腔内，紧贴咽后壁插入食道（1ml注射器，深度大约为3cm）,推动针管给药（生理盐水） 注意不要插入气管，不要抓的太紧以致小鼠窒息死亡,2019,-,19,3、研究方法,实验仪器与设备： PCR扩增仪 凝胶成像系统 Z323K高速冷冻型离心机 DYY-12电泳仪、立式电泳仪 UV-2450紫外分光光度计,实验试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶 回收试剂盒、PCR扩增全套试剂 、 I型核酸染色剂 、琼脂糖(分析纯) 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺(超级纯)、引物,实验动物：SD大鼠，雌雄各半，体质量(190 20) （g）,2019,-,20,3、研究方法,2019,-,21,3、研究方法,对粪便中细菌菌体的DNA进行提取：,2019,-,22,3、研究方法,分子生物技术对肠道菌群DNA进行研究,2019,-,23,DGGE电泳分析,将改进溶菌酶法和试剂盒法提取的DNA进行PCR扩 增，再用CB2 柱纯化PCR 产物，用变性梯度为35%70%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1TAE， 电泳温度55，电压120V，时间10h；银染后拍照1,2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp,3、研究方法,-,4预计的结果和感想,1、3 种DNA 提取方法琼脂糖凝胶电泳结果: 蛋白酶K-CTAB 法提取的DNA，样品可能有少量蛋白质污染 试剂盒法提取的样品DNA 纯度较高，但得率不高 改进后的溶菌酶法DNA 提取效果最好 本研究采用分子生物学技术、DGGE分析的大鼠粪便及肠道细菌DNA提取方法研究，通过PCR-DGGE电泳分析法对模型大鼠的肠道菌群进行动态监控，分析饮用铁罗汉的大鼠和健康（或饮用清水）的大鼠及腹泻的大鼠进行对照，比较有益菌群和致病菌群发生的变化。并逐步实验分析哪种成分起到该效果。挖掘出铁罗汉治疗痢疾等症状的药用机理，并更好地运用此机理来生产相应药品。在老师、或学长学姐的帮助下，确立并完善该课题研究。,2019,-,25,2、3 种方法获得的总DNA 质量比较:,3 种提取方法得到的DNA 纯度均能达到要求 蛋白酶K-CATB 法的DNA质量浓度较低，OD值却较高，可能是由于蛋白质少量残留和RNA 抽提不完全造成的 就DNA 质量浓度和得率而言，改进溶菌酶法在3 种方法中最优,2019,-,26,3、提取DNA 的16S rDNA 通用引物PCR 扩增检测：,蛋白酶K-CTAB 法提取的DNA 样品PCR 扩增目的条带几乎不可见 试剂盒法提取的DNA 样品PCR扩增目的条带较弱 经改进溶菌酶法提取获得的样品DNA 通过PCR 扩增，获得了高亮度、清晰的目的条带,2019,-,27,4、菌群多样性DGGE分析结果：,由于蛋白酶K-CTAB 法没有扩增出目的条带，所以不进行DGGE 讨论比较 改进溶菌酶法提取的DNA 样品的菌群丰度优于试剂盒法。,2019,-,28,蛋白酶K-CTAB 法利用CTAB 裂解液进行的提取可以有效去除粪便中的色素和多糖成分，但CTAB 的少量残留会对酶活性有很大影响，且操作要求较高，难以标准化，使得该方法不适合大量提取DNA 使用。此外，蛋白酶K-CTAB 法虽然能提取一定量的DNA，但用于PCR 却只能见到微弱条带，可能原因是提取的DNA 纯度不够，提取出的DNA 可能是粪便中植物残渣的DNA，也可能是CTAB 的少量残留抑制了PCR过程中Taq 酶的活性。 试剂盒法获得的DNA 纯度较高，但对样品的预处理纯度要求也很高，在提取过程中往往会出现预处理杂质去除不完全和蛋白质水解不彻底导致柱子阻塞，从而影响样品DNA 的吸附和洗脱。另外，试剂盒法的成本也高于常规方法。 改进后的溶菌酶法对操作要求低，相对耗时短，提取全过程可控制在2h 左右。在DNA 提取得率上优于蛋白酶K-CTAB 法和试剂盒法，在试剂成本上低于试剂盒法。琼脂糖凝胶电泳、细菌通用引物P C R 扩增和DGGE 分析结果显示，该方法用于提取大鼠粪便及肠道微生物基因组D NA ，快速、经济、有效，适用于处理大批量样品和后续基于16S rRNA 技术的肠道菌群DGGE 分析