Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响.doc

Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcrabl融合基因表达的影响作者：王玮孙秉中于文彬冯琦【关键词】染料木黄酮关键词:染料木黄酮；CyclinD1基因；CDK4蛋白；bcr-abl融合基因摘要:目的研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响.方法用RT-PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化，用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡.结果K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mR-NA和CDK4蛋白表达阳性，用Genistein与K562细胞共同孵育后，bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性，CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降，细胞阻滞于G2/M期，K562细胞出现凋亡.结论bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达，Genistein能使K562细胞生长受抑，诱导其凋亡，抑制bcr-abl基因的mRNA表达，并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降，表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系.Keywords:Genistein；CyclinD1gene；CDK4protein；bcr-ablfusiongeneAbstract:AIMToinvestigatethemechanismofhowGenis-teinrestrainsthegrowthofK562cells，anditseffectontheexpressionofCyclinD1geneandbcr-ablfusiongene.METHODSGenisteinwasincubatedwithK562cells，themRNAofCyclinD1geneandbcr-ablfusiongenewereexam-inedbyRT-PCRandtheexpressionofCDK4protein，cellcy-cleandapoptosiswereexaminedbyimmunofluorescence，flowcytometryandelectron-microscopeatthesametime.RESULTSTheexpressionofCyclinD1geneandbcr-ablfu-siongenemRNAwaspositiveinK562cells.AfterK562cellswasincubatedwithGenistein，theexpressionofbcr-ablfusiongenemRNAandCDK4proteinwerenegative，mRNAofCyclinD1genedecreased.AndthecellwasblockedinG2/Mphase.Usingelectron-microscopewecouldobservethecellsapoptosis.CONCLUSIONCyclinD1geneandbcr-ablfusiongenearehighlyexpressedinK562cells.ThegrowthofK562cellscouldberestrainedbyusingGenistein，whichinducesK562cellsapoptosis，represstheexpressionofbcr-ablfusiongene，andmakesCyclinD1andCDK4proteinde-crease.ThisilluminatesthatCyclinD1gene，CDK4proteinandbcr-ablfusiongenemayhaverelationtothepathogenesisofchronicmyelogenousleukemia（CML）.0引言肿瘤的发生、发展与细胞周期调控失调密切相关，细胞周期有关的原癌基因（如CyclinD1）与细胞增殖相关的癌基因（如bcr-abl）在肿瘤发展上存在密切关系.已有文献1，2报道，用RT-PCR方法检测到K562细胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA高表达，我们进一步用酪氨酸激酶抑制剂Genistein作用于K562细胞后，观察CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达的变化，同时观察Genistein对K562细胞生长、周期变化及凋亡的影响，探讨其抑制K562细胞生长的机制.1材料和方法1.1材料K562细胞株由西京医院血液科于文强博士惠赠.Genistein购于美国Sigma化学制剂公司，CDK4单抗购于美国SantaCruz化学制剂公司（由博士德公司提供），扩增CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的引物由大连宝生物Takara公司合成.1.2方法1.2.1细胞培养K562细胞用含100mL・；L-1胎牛血清的RPMI1640培养液置37，50mL・；L-1CO2孵箱中培养，实验取对数生长期细胞.绘制细胞生长曲线，每隔24h台盼蓝染色，计算细胞存活率.1.2.2RT-PCR检测CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达将对数生长期细胞接种于6孔培养板中，细胞密度为3109・；L-1，加入40mg・；L-1的Genistein，置37，50mL・；L-1CO2孵箱中培养48h后，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法抽提总RNA，反转录成cDNA后进行PCR扩增.扩增Cy-clinD1基因的引物顺序:上游引物5-CTGGCCAT-GAACTACCTGGA-3，下游引物5-GTCACACT-TGATCACTCTGG-3，扩增483个bp1；扩增bcr-abl基因引物序列:上游引物5-GATGCTGAC-CAACTCGTGTG-3，下游引物5-ACACCATTCC-CCATTGTGAT-3，扩增376个bp3，10g・；L-1琼脂糖电泳检测扩增产物.1.2.3检测细胞周期、凋亡及CDK4单抗用流式细胞仪检测，取2106个细胞，700mL・；L-1乙醇（-20预冷）固定24h，离心，弃去乙醇，细胞重悬浮于PBS液中离心洗涤2次，去上清，细胞重悬浮于DNA染液中（含碘化丙锭），室温避光染色30min，取波长488nm蓝色激发光检测4.参照文献5检测CDK4单抗.电镜观察K562细胞凋亡形态.2结果2.1Genistein抑制K562细胞株生长Genistein浓度40mg・；L-1时即可明显抑制K562细胞的生长，50.0%细胞生长被抑制时间约48h，作用72h内台盼蓝染色未见死细胞，细胞生长曲线如Fig1.2.2CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA表达降低K562细胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达均为阳性.Genistein作用48h后，bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性，CyclinD1基因mRNA表达降低，电泳检测扩增产物，荧光亮度轻度减弱（Fig2，3）.2.3Genistein阻断细胞生长于G2/M期及诱导K562细胞凋亡流式细胞仪检测K562细胞S期细胞占47.7%，提示其DNA的合成、复制活跃，细胞增殖旺盛（Fig4）；Genistein与K562细胞共同作用后，阻断K562细胞生长主要在G2/M期，使G2/M期细胞数大量增加，S期细胞明显减少（19.5%），并在细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰-凋亡峰（apoptosispeak），提示其能抑制K562细胞生长，诱导其凋亡（Fig5）.图1图3略2.4CDK4蛋白的表达下降K562细胞中CDK4蛋白表达阳性（平均荧光强度2.10），Genistein作用24h后，CDK4蛋白的表达水平明显下降（平均荧光强度0.807，Fig6，7）.图4图7略2.5电镜观察到K562细胞凋亡Genistein作用24h后，K562细胞变小，胞质轻度变性肿胀，核浓缩深染，核膜清楚，染色质聚集成团块状，靠近核膜边缘（Fig8）.并可见早期凋亡小体，核碎裂呈团块状散布于胞质，被细胞膜所包绕，其中无各种细胞器.3讨论K562细胞为慢性粒细胞白血病（慢粒）急变细胞株，含有Ph染色体，产生bcr-abl融合基因，编码p210Bcr-Abl蛋白，具有异常的高酪氨酸激酶活性，使细胞恶性增殖6.近来研究发现慢粒发病和凋亡受抑7以及细胞周期调控失调8有密切联系，Genis-tein治疗慢粒的机制主要是阻断信号传导途径，促进细胞凋亡.其是否在基因水平及细胞周期调控角度发挥抗肿瘤作用，值得进一步研究.Carler等9研究发现Genistein能诱导慢粒患者骨髓中Bcr/Abl阳性集落进入凋亡，我们用Genis-tein作用于K562细胞后，出现细胞凋亡和G2/M期阻滞，说明Genistein除能抑制p210蛋白的酪氨酸激酶活性外，尚能从促进凋亡和调控细胞周期角度抑制K562细胞的生长.其诱导K562细胞凋亡的机制，主要是阻断了与bcr-abl相关的信号传导途径（如Ras途径）后，抑制抗凋亡基因bcl-2的表达，并促使凋亡基因fas等发挥作用10.此外，细胞周期的改变，亦是促进细胞凋亡的因素，因G2/M期细胞明显增加，变异基因bcr-abl被阻滞于G2/M期检测点，不能进入M期进行有丝分裂，使其在退出细胞周期过程中逐渐发生凋亡.图8略我们发现，Genistein能抑制bcr-abl融合基因的mRNA表达.Carmelo等2的研究已排除Genistein通过抑制bcr-abl的转录起作用的机制，故可能是抑制了bcr-abl基因的复制.从细胞周期角度分析，Genistein作用K562细胞后使S期细胞数量明显减少，导致DNA的合成、复制减少，变异基因bcr-abl的合成和复制相应减少，故bcr-abl融合基因的表达降低.同时发现Genistein能使cyclinD1基因的mR-NA表达下降.Cortez等11研究bcr-abl融合基因的高酪氨酸激酶活性，可使造血细胞在失去生长因子的条件下激活CDK蛋白.本实验用Genistein抑制了K562细胞中的高酪氨酸激酶活性后，流式细胞仪检测证实能抑制CDK4蛋白的表达，而CyclinD1的表达依赖于CDK4蛋白的活化，因而CyclinD1基因的表达水平下降.在K562细胞中同时有CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的高表达，表明CyclinD1基因和bcr-abl基因对慢粒发展可能有密切的联系.Cy-clinD1的过表达使细胞周期中G1/S期检测点功能低下，变异的bcr-abl癌基因失去调控而进入S期复制，不能启动凋亡途径而凋亡，还能使细胞周期及癌基因的复制加速，故CyclinD1基因对bcr-abl融合基因的表达起促进作用.但原癌基因CyclinD1单独作用不能使细胞发生恶性转化12，必须通过癌基因bcr-abl而发挥作用.参考文献:1UchimaruK，TaniguchiT，YoshikawaM，AsanoS，ArnoldA，FujitaT，MotokuraT.DetectionofCyclinD1（bcl-1，PRAD1）over-expressionbyasimplecompetitivereversetranscription-polymerasechainreactionassayint（11，14）（q13，q32）-bearingB-cellmalignanciesand/orMantlecelllymphomaJ.Blood，1997；89（3）:965-974.2CarmeloCS，GianpietroD，LinaM，EsterR，DanielaG，Anto-nioB，CamilloA，GabriellaS，BarbaraS，MariaTR，VittorioR.SelectionofmyeloidprogenitorslackingBCR-ABLmRNAinchronicmyelogenousleukemiapatientsafterinvitrotreatmentwiththetyrosinekinaseinhibitorGenisteinJ.Blood，1996；88（89）:3091-3100.3FengQ，SunBZ，ZhaoYT，SunK，YanZ，HanW，ZhangYQ.Studyonthecleavageabilityofthreerihozymesspecifictothedifferentsitesofbcr-ablfusiongeneJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），1999；20（4）:284-287.4CaoRX，LiuZG，QuP，ZhangYF.ArapidwayofdeterminingactivityofcellsbyflowcytometryJ.Di-siJunyiDaxueXue-bao（JFourthMilMedUniv），2000；21（7）:S198.5CaoYX，LiuZG，ZhongXN，DongJY.Indirectstainingofpe-ripheralbloodsamplesforflowcytometryJ.Di-siJunyiDax-ueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（2）:244-246.6FengQ，SunBZ，ZhaoYT，SunK，YanZ，HanW，ZhangYQ.Constructionandidentificationofachronicmyeloidleukemiaspecificbcr-abl3-unitsribozymeJ.Di-siJunyiDax-ueXuebao（JFourthMilMedUniv），1998；19（4）:471-472.7ShangZC，SunBZ，FengQ，WangCH，XieXP，SongTT，ZhuHF.Thesynergisticeffectsofbcr-ablandc-mycanti-senseoligodeoxynucleotidesonchronicmyeloidleukemiaJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（3）:275-277.8BediA，BarberJP，BediGC，DeneyWS，SidranskyD，ValaMS，