瘢痕疙瘩真皮-表皮连接区结构的组织形态学变化.doc

瘢痕疙瘩真皮-表皮连接区结构的组织形态学变化作者：姜笃银陈璧贾赤宇董茂龙徐明达【关键词】瘢痕疙瘩关键词:瘢痕疙瘩；基底膜；免疫组织化学；组织形态学摘要:目的观察瘢痕疙瘩（Ks）真皮表皮连接（DEJ）区结构变化.方法对瘢痕疙瘩浸润部、增生部和老化部及其正常皮肤（NS）标本，采用组织学、免疫组化laminin，vWF标记和DEJ区结构扫描电镜观察.结果DEJ区laminin和基底膜厚度、真皮乳头密度和乳头间孔穴密度，表皮内面基底细胞质膜皱襞密度、孔穴密度及其粘附细胞密度（EACD），真皮乳头层微血管密度（MVD）等指标，各组均有显著的病理改变.统计学处理:浸润部>；增生部>；老化部或（和）正常皮肤（t，P<；0.050.01）.除真皮乳头和基底细胞质膜皱襞密度外，MVD或EACD与其他指标的均数间呈明显正相关（t，P<；0.050.001，r=0.3720.681）.结论Ks不同部位DEJ区结构有显著不同的病理改变，可能与真皮乳头的微血管增生和阻塞及免疫细胞向表皮内大量浸润有关.Keywords:keloid；basementmembrane；immunohis-tochemistry；histomorphologyAbstract:AIMToobservetheconstructionchangeofder-mal-epidermisjunction（DEJ）inkeloids（Ks）.METHODSHistology，immunohistochemicallabeling（lamininandvWF）andscanningelectronicmicroscopewereappliedtoinvestigatetheinvasivingzone，proliferativezone，agedzoneofkeloidsandnormalskinspecimen.RESULTSThereweremarkedpathologicalchangesinlamininofDEJ，thicknessofbasalmembrane，dermalpapilladensity，holedensityinpapillas，folddensityofbasalcytoplasmicmembrane，holedensityandadherencecelldensity，microvesseldensityinpapillalayerofdermal，invasivingzone>；proliferativezone>；agedzoneandNS（t，P<；0.050.01），exceptdermalpapillaandfolddensityofbasalcytoplasmicmembrane，suchindexesasMVDandEACDarepositivelyrelatedtoeachother（tr，P<；0.050.001，r=0.3720.681）.CONCLUSIONMarked-lydifferentpathologicalchangeofDEJappearedindifferentzoneofkeloids，andthatmayberelatedtoproliferationandocclusionofmicrovesselindermalpapillalayerandinfiltra-tionofimmunecellsinepidermis.0引言瘢痕疙瘩（keloids，Ks）是易感个体皮肤外伤愈合等后在水平和垂直两个方向上结缔组织过度增生而形成的真皮良性肿瘤.组织学上瘢痕疙瘩与增生性瘢痕相似，均呈现纤维细胞增生和胶原大量沉积.由于具有侵袭性生长的特性，因而又赋予它与一般增生性瘢痕不同的临床表现和病理过程，即典型的瘢痕疙瘩由外向内可分为浸润部、增生部和老化部1.瘢痕疙瘩上述3个不同部位是由正常皮肤逐渐发展而成的.有关瘢痕疙瘩的真皮-表皮连接（dermal-epi-dermisjunction，DEJ）区结构的病理改变未见文献报道.为此，我们收集瘢痕疙瘩不同部位标本，通过组织学、Laminin（LN）和vonWillerbrandfactor（vWF）免疫组化标记和扫描电镜（SEM）观察，探讨瘢痕疙瘩DEJ区组织形态学变化及其发生机制.1对象和方法1.1对象瘢痕疙瘩标本均取自我院门诊和住院手术患者23（男9，女14）例，年龄245岁.其中胸骨柄区9份，面颈部2份，肩三角肌和上背部7份，耳垂部5份.瘢痕疙瘩标本取材分成中央凹陷的老化部15份；表面潮红隆起的增生部23份及其与正常皮肤交界的浸润部13份；留边缘正常皮肤（NS）10份为对照.除电镜标本外，新鲜标本用40g・；L-1多聚甲醛缓冲液固定，石蜡包埋.1.2方法1.2.1组织学观察连续5m组织切片，分别作HE，PAS染色，观察DEJ区乳头、皮钉和基底膜（BM）结构.用目镜尺测微器测定各标本5个不同部位的BM厚度（m）和乳头密度（个/mm2），取均值.1.2.2免疫组化染色和观察5m石蜡切片捞于APES胶包被的载玻片上.常规设PBS和山羊血清代替第一抗体的阴性对照.所有标本采用SP（kit，福建Maxim公司）方法作鼠抗人LNIgG（福建Maxim公司）和兔抗人vWFIgG（DAKO）免疫组化标记，DAB显示棕黄色阳性信号，分别定位于BM和微血管内皮细胞（mVEC）胞质，背景淡黄或无色.观察:乳头浅层mVEC增殖水平及血管结构（BM和管腔）；DEJ区BM结构；高倍镜（400）下采用目镜网格测微器（5/25）观察10份标本的各5个单位面积内微血管与网格交叉点数的平均数，以此代表微血管密度（MVD，交叉点数/mm2）；测定DEJ区LN和BM各5点的厚度（m），取均值.1.2.3SEM样本制作2和观察每组各5块新鲜组织，修成1.0cm1.0cm0.3cm大小，PBS（pH7.4）冲洗后入1.25g・；L-1dispase（日本）消化液内424h，小心分离表皮和真皮，直接置入40mL・；L-1戊二醛-多聚甲醛液内固定，按常规方法3制成SEM样本，JSMT-200扫描电镜观察.采用SEM上的标示尺计算单位面积（mm2）内真皮表面乳头密度（DPD）、真皮孔穴密度（DHD），表皮内面的波纹状皱襞密度、表皮孔穴密度（EHD）及其表皮粘附细胞密度（EACD）的平均数.统计学处理:各组计量资料t检验，微血管密度和粘附细胞密度与KsDEJ区结构相关的指标之间作单因素相关分析和r值和t检验.2结果2.1光镜观察正常皮肤组表皮各层细胞分化良好，层次清楚，基底细胞均匀排列于锯齿状BM上，乳头和皮钉或腺嵴的纵轴与表皮垂直，大小对称，分布规律，BM粗细均匀、连续.浸润部:表皮明显增厚（有1320层表皮细胞），细密的基底细胞紊乱地排列于增厚、断裂、松散或分层的BM上，部分BM已与基底细胞分离，散落于乳头基质中，倾斜的乳头和皮钉增宽变浅，乳头数量减少，乳头内血管BM增厚、阻塞.增生部组:表皮变薄，细胞分化差，DEJ区BM粗细不均，于乳头和皮钉交界处明显增厚、分层，有断裂现象（Fig1），乳头或皮钉明显减少.老化部组:表皮变薄，乳头和皮钉近乎消失，BM变薄、呈断续状.各组光镜下真皮乳头密度（个/mm2）为:NS（6.60.5）>；浸润部（4.00.5）>；增生部（1.80.4）>；老化部（0.40.1）（t，P<；0.001），各组BM厚度（m）依次为:浸润部（2.90.5）>；增生部（2.30.3）>；老化部（1.50.2）和NS（1.60.2）（t，P<；0.01）.2.2免疫组化观察2.2.1正常皮肤LN分布于含BM的部位，以DEJ区BM显色最强，于表皮基底细胞底部呈线状均匀着色，位于皮肤附件周围和mVEC底部及LN较纤细.上述各部位的LN，在疤痕疙瘩均有不同程度的病理改变，非BM部位的胶原组织内也有团索状轻度着色.浸润部:DEJ区LN粗细不均，于真皮侧着色，有裂隙或间断、疏松或分层和剥脱等表现.LN增粗部位多见于乳头和皮钉交界部位，乳头内毛细血管BM增厚、闭塞或改建.萎缩或退变的皮肤附件周围LN染色弱或消失；增生部:DEJ区LN平直，粗细不均，厚度较浸润部下降，但真皮组织内非特定部位LN着色明显增强；老化部:LN呈点线状着色不均，残留在极少数正常皮肤附件的外周，LN着色与正常皮肤相近.各组LN厚度（m）依次为:浸润部（1.80.4）>；增生部（1.20.2）>；NS（0.90.1）和老化部（0.70.2）（t，P<；0.01）.2.2.2正常皮肤vWF乳头层微血管粗细相近、分布规律，由乳头层呈垂直走向终止于乳头内；浸润部:浅层微血管扩张、分布不规律，乳头内mVEC向管腔内外增生，毛细血管大多闭塞或改建，微血管数量和密度均明显增加；增生部:浅层微血管高度扩张，多数因mVEC增生紊乱或管壁扭曲致管腔梗塞，其血管内外均可见mVEC，乳头部位的毛细血管密度降低或消失；老化部:微血管数量、密度和病理改变均明显减少.NS，浸润部，增生部和老化部乳头层MVD值（xs）依次为:30248，41693，37261和28141.统计学t检验结果为浸润部>；增生部（P<；0.05）>；NS和老化部（P<；0.001）.2.3SEM观察2.3.1正常皮肤真皮表面结构乳头大小均匀、排列整齐，呈圆柱状，高耸垂直，顶端钝圆，表面有波纹状BM覆盖；乳头之间的峡谷区也覆盖着网状的BM（Fig2），其间有直径530m的孔穴，散在分布，未见BM覆盖；浸润部:乳头排列尚均匀，但乳头逐渐萎缩变小、倾斜或倒伏，皱缩的乳头呈叶片样卷曲（Fig3），增宽的乳头间区域BM粗细不均、分布少量的无BM覆盖的孔穴，直径约5.0120m，偶见汗腺管突出于此；增生部:乳头枯萎、稀少，完全倒伏于真皮表面，乳头间孔穴数量较浸润部少；老化部:典型的乳头几乎消失，真皮表面平坦，孔穴大小和数量明显降低.各组真皮表面乳头密度和真皮乳头间孔穴密度比较，结果（Tab1）分别为:正常皮肤>；浸润部>；增生部>；老化部（t，P<；0.001）；浸润部>；增生部（t，P<；0.05）>；老化部>；NS（t，P<；0.001）.图1图6略2.3.2正常皮肤表皮内面结构有与乳头大小和外形相近、分布均匀的乳头孔，基底细胞呈螺旋状排列，其表面有与细胞排列方向平行一致的波纹状皱襞（注:为基底细胞真皮侧的质膜皱褶），可见散在孔穴和与表皮相连的皮肤附件结构；浸润部:与正常皮肤的移行部，乳头孔外形和大小接近NS，孔内有膜片状结构附着，向增生部移行部位的乳头孔较正常小而浅，孔内多有分层的膜片状结构（Fig4），与光镜下（PAS特殊染色）所见增厚分层的LN结构十分相似；膜表面有细颗粒状结构凸出，膜下呈松散网状结构，与丰富的基底细胞膜皱襞相连接，皱襞常成双并列伸向真皮侧，异常增厚和致密（Fig5），整个表皮内面有密集的直径约530m的细小孔穴，可见较多直径约1012m球形和树突状细胞粘附（Fig4）；增生部:乳头孔逐渐减少、消失，细长的波纹状皱襞平行排列，相间细小孔穴，其数量和粘附细胞均较浸润部少.在浸润部（多见）和增生部孔穴部位基底细胞表面可见大小均匀、直径约0.5m的囊胞状结构（vesicularstructure）凸向孔穴，中央可见细小凹陷（Fig6）；老化部:典型乳头孔已完全消失，表面平坦，波纹状皱襞稀少、分布不规律，孔穴变小、密度下降.统计学t检验（Tab1），表皮内面皱襞密度（EFD）依次为:浸润部>；增生部（P<；0.001）>；老化部>；NS（P<；0.05），表皮内面孔穴密度（EHD）依次为:浸润部>；增生部>；老化部>；NS（P<；0.001）.表皮内面粘附细胞密度依次为:浸润部>；增生部>；老化部>；NS（t，P<；0.001）.表1瘢痕疙瘩各部位DEJ区结构密度比较略瘢痕疙瘩各部乳头层（瘢痕浅层）MVD或EACD与DEJ区BM和LN厚度、DPD，DHD，EFD，EHD均数作单因素相关分析，r值和t检验结果如Tab2，除DPD和EFD外，MVD或EACD与DEJ区结构病理改变呈明显正相关.表2瘢痕疙瘩EACD或MVD与DEJ区结构密度的相关性分析略3讨论我们采用dispase分离表皮和真皮（或瘢痕）后，按常规制作显示DEJ区结构的SEM样本2，能非常清晰地显示真皮表面和表皮内面的细微结构，包括:真皮乳头、乳头间孔穴及其表面覆盖的BM，表皮内面的乳头孔、孔间隆起区域（相当于光镜下皮钉部位）、表面孔穴及其表面粘附细胞和基底细胞质膜形成的波纹状皱襞.说明此方法是可靠的，能同时获取DEJ区真皮和表皮连接的两个层面上的信息资料.临床和组织学将瘢痕疙瘩分为浸润部、增生部和老化部3个不同部位1.光镜和SEM水平观察上述三者DEJ区结构有明显的区别:瘢痕疙瘩浸润部组织形态学变化最为明显，BM和LN表现增厚、分层、断裂或与基底细胞剥离，真皮乳头萎缩、倒伏和密度锐减，表皮内面孔穴及其粘附细胞密度增加，基底细胞表面皱襞发达