活性调节细胞骨架蛋白mRNA 在大鼠岛叶电点燃模型海马中的表达.doc

基金项目：国家自然科学基金资助（30750014）；宁夏自然科学基金资助(NZ09118)作者单位：750004银川，宁夏医科大学附属医院神经外科；宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室通信作者：孙涛，Email：活性调节细胞骨架蛋白mRNA在大鼠岛叶电点燃模型海马中的表达张培松王峰刘庆祝徐文中齐江华刘铮孙涛【摘要】目的探讨电点燃和单一电刺激大鼠岛叶模型ArcmRNA在海马中的表达及意义。方法雄性SD大鼠随机分为点燃组、单一电刺激组、假手术组和正常对照组，每组按时间点分两个亚组。点燃组：建立电刺激岛叶慢性癫痫模型，按时间点实验后断头取脑，应用RT-PCR进行海马ArcmRNA的检测；应用原位杂交进行齿状回ArcmRNA的检测；单一电刺激组：只刺激两次，余同点燃组；假手术组只是不行点燃刺激，余同点燃组；正常对照组不给予手术干预。结果单一电刺激组、假手术组和空白对照组在3h时ArcmRNA表达分别为0.720.14，0.750.16，0.710.14，显著低于点燃组海马组织中ArcmRNA的表达1.780.43（P0.05）；原位杂交细胞计数显示：点燃后3hArcmRNA的表达为112.8个6.0个，显著高于单一电刺激组、假手术组和空白对照组ArcmRNA的表达，分别为46.25个4.35个，45.25个6.23个，44.75个6.49个（P0.05）。结论岛叶癫痫发作可引起海马ArcmRNA表达增加；突触可塑性在岛叶癫痫中起着重要作用。【关键词】岛叶；活性调节细胞骨架蛋白；点燃；突触可塑性mRNAexpressionofactivity-regulatedcytoskeletal-associatedproteininthehippocampusinducedbytheinsular-kindledratsZHANGPei-song,WANGFeng,LIUQing-zhu,XUWen-zhong,QIJiang-hua,LIUZheng,SUNTao.DeparmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofNingxiaMedicalUniversity,KeyLabofCraniocerbralDisease,NingXiaHuiAutonomousRegion,Yinchuan750004,ChinaCorrespondingauthor：SUNTao，Email：【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofArcmRNAininsularelectricalkindledandasingleelectricalstimulatedratsanditssignificance.MethodsMaleSDratsweredividedintokindledgroupandasingleelectricalstimulatedgroupandsham-operatedgroupandcontrolgrouprandomly,eachgroupisdividedinto2sub-groupsatdifferenttimepoint.Kindledgroup:toestablishchronicinsularelectricalkindledmodel,andthendecapitatetomakeRT-PCRofArcmRNAonhippocampus,andtoapplyInSituHybridizationofArcmRNAondentategyrus；Asingleelectricalstimulatedgroup:usethesamemethodtothekindledgroupwithonlytwiceelectricalstimulation.Sham-operatedgroup:usethesamemethodtothekindledgroupwithoutelectricalstimulation.Controlgroup:withoutsurgery.ResultsExpressionofArcmRNAinthehippocampusofasingleelectricalstimulatedgroupandsham-operatedgroupandcontrolgroupwere0.720.14，0.750.16，0.710.14,significantlylessthankindledgroupthatwas1.780.43（P0.01）at3h,theexpressionofArcmRNAwasnosignificantdifference(P0.05)among4groupsat6h；ArcmRNAinsituhybridization(cellcount)showedtheexpressionofArcmRNAinkindledgroupwas112.86.0,significantlyhigherthanasingleelectricalstimulatedgroupandshamoperationgroupandcontrolgroupthatwere46.254.35，45.256.23，44.756.49（P1h，连续刺激至少6d，直至出现5次级发作，视为点燃成功。以最后一次刺激为准，然后在3、6h时无痛处死大鼠。发作强度按Racine分级评分：级：不动、闭眼，面肌轻微痉挛；级：点头；级：单侧前肢阵挛；级：双前肢阵挛；级：全身阵挛发作。三、标本采集及保存各组大鼠按时间点乙醚麻醉，一部分断头取脑，迅速剥离左侧海马组织，液氮中冷冻，然后转移到1.5mlEP管，-80保存。一部分用PBS及多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑，4多聚甲醛后固定，蔗糖脱水，液氮中OCT包埋后保存于-80冰箱中。美国LEICA恒低温切片机行左侧半脑冠状冰冻切片，片厚14m，行ArcmRNA原位杂交实验。四、RNA提取及RT-PCR检测ArcmRNA在左侧海马中的表达1按TRIzol法提取RNA。TRIzol由invitrogen提供。2RT-PCR：引物设计参考文献2设计的Arc引物序列：上游引物：5-ACAGAGGATGAGACTGAGGCAC-3，下游引物：5-TATTCAGGCTGGGTCCTGTCAC-3，扩增77bpDNA片段；内参肌动蛋白：上游引物：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3，下游引物：5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3，扩增150bpDNA片段，以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RT-PCR试剂盒购于promega公司，反应体系为25l：AMV/Tfl5反应缓冲液5l,dNTP混合物（每dNTP10mmol/L）0.5l，上下游引物10mol/L各1.5l，25mmol/LMgSO41l，AMV反转录酶（5U/l）0.5l，TflDNA聚合酶（5U/l）0.5l，RNA样品1g，加无核酸酶水至25l。反应条件为：48，45min反转录，94，2minAMV反转录酶灭活RNA/cDNA/引物变性；9515s变性，5840s退火，7230s延伸共40个循环；72，7min总延伸。PCR产物鉴定：取2.5lPCR产物,4%琼脂糖凝胶，100V电泳40min后观察。电泳完毕后,将电泳凝胶置于SYNGENE凝胶图像分析系统上分析，以Arc与肌动蛋白的吸光度比值表示最终结果。五、ArcmRNA原位杂交原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，具体实验过程按试剂盒说明书操作。ArcmRNA胞质染成棕黄色颗粒（图5A箭头），在高倍（400倍）显微镜下随机选取齿状回3个视野进行单位面积细胞计数，以3个视野的平均数表示最终结果。六、统计学分析应用SPSS12.0统计软件。实验数据均用sx表示，成组设计多组均数的比较用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验；同组不同时间点比较采用重复测量的方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。结果1癫痫发作：电刺激大鼠岛叶后放阈为(648士139)A。点燃速度为(8.6土2.1)d。点燃大鼠最初表现为动须、闭眼、面肌痉挛、节律性咀嚼，接着前肢抬起、抽搐随即跌倒，最后以湿狗样抖动结束，发作时间持续约30s至几分钟。2脑电图：点燃组大鼠背景脑电图与正常脑电图差异无统计学意义（F=1.197，P0.05）；点燃大鼠脑电图显示慢波节律增多，间断出现尖波、棘波（图1B），并与湿狗样抖动动作同步。AB图1AlphaLab脑电同步记录系统记录大鼠脑电图A：正常脑电图B：级发作时脑电图LFP：局部场电位（V）3脑电频率场电位：点燃大鼠级发作时导致大脑神经元异常和过度超同步化放电，使其脑电频率明显增加。与正常脑电频率相比点燃大鼠级发作时脑电频率增加差异有统计学意义（F=1963.611，P0.01）。AB图2AlphaLab脑电同步记录系统记录大鼠脑电频率场电位A:正常脑电频率，主要集中在56Hz内B：点燃大鼠级发作时的脑电频率，主要集中在2830Hz4海马ArcmRNA的表达：RT-PCR结果(图3，4)显示：3h4组间ArcmRNA表达差异有统计学意义（F=31.064，P0.01），其中点燃组与单一电刺激组、假手术组、空白组相比ArcmRNA表达在3h均显著增高（P0.01）；6h四组间ArcmRNA表达差异无统计学意义（F=0.400，P0.05）；点燃组ArcmRNA表达在3和6h差异有统计学意义（F=30.783，P0.01），3h表达明显增高。M：标准参照物；1:ArcmRNA；2:肌动蛋白mRNAA：空白组；B：点燃组3h；C：点燃组6h；D:单一电刺激组3h；E：单一电刺激组6h；F：假手术组3h；G：假手术组6h图3各组大鼠不同时间点间ArcmRNA扩增后的电泳图点燃组与其他4组及不同时间点比较ArcmRNA在3h均aP0.01图4：各组大鼠不同时间点海马结构区ArcmRNA的表达5齿状回ArcmRNA的表达：原位杂交结果(图5，6)显示：3h4组间ArcmRNA表达差异有统计学意义（F=204.692，P0.01），其中点燃组与单一电刺激组、假手术组、空白组相比ArcmRNA表达在3