HPLC 法测定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量[J].pdf

HPLC法测定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量耿志旺，刘蔚，刘茜，乐健*(上海市食品药品检验所，上海201203)摘要目的:建立丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的HPLC检测方法。方法:采用PhenomenexLunaC18柱(100mm4.6mm，5m)，梯度洗脱流动相A为0.66%四丁基氢氧化铵溶液乙腈(31)(用磷酸调pH至6.5)，B为水甲醇(19)，流速1.0mLmin1，检测波长为260nm。结果:乙二胺四乙酸二钠峰不受辅料干扰，在2080gmL1浓度范围内线性关系良好(r=0.9999)，高、中、低3种不同浓度的回收率分别为100.7%，100.5%，100.7%。结论:本方法操作简便，精密度好，结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制。关键词:丙泊酚射液；乙二胺四乙酸二钠；含量；高效液相色谱法中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:02541793(2011)03058603HPLCdeterminationofEDATNa2inPropofolInjectionGENGZhiwang，LIUWei，LIUQian，LEJian*(Shanghaiinstituteforfoodanddrugcontrol，Shanghai201203，China)AbstractObjective:ToestablishanHPLCmethodfordeterminationofEDATNa2inpropofolinjectionMeth-ods:PhenomenexLunaC18column(100mm4.6mm，5m)andgradientelutionwereusedMobilephaseAwas0.66%tetrabutylammoniumhydroxidesolutionacetonitrile(31)(pHwasadjustedto7.0byphosphoricacid)，andmobilephaseBiswatermethanol(19)，theflowratewas1.0mLmin1andthedetectionwavelengthwas260nmResults:ThedateshowedthatEDATNa2inpropofolinjectioncouldbedetectedexcludingexcipientsin-terferingCalibrationcurvewaslinearrangeof2080gmL1(r=0.9999)，andtheaveragerecoveriesofitshigh，middleandlowconcentrationswere100.7%，100.5%and100.7%，respectivelyConclusions:Thismethodissimple，accurateandreliable，soitcanbeusedforqualitycontrolofEDATNa2Keywords:propofolinjection；EDTANa2；assay；HPLC丙泊酚注射液(商品名:得普利麻)，广泛用于全身麻醉的诱导和维持，常与脊髓麻醉和硬脊膜外麻醉同时应用1。该注射剂为乳剂，适量的乙二胺四乙酸二钠可防止金属离子破坏体系的稳定性。乙二胺四乙酸二钠在丙泊酚注射液中的浓度必须在安全、有效的范围之内，其含量是该注射液质量控制的重要指标。目前，进口药品注册标准采用有机溶剂萃取出注射液中的游离脂肪酸，用高效液相色谱法测定水相中乙二胺四乙酸二钠的含量。由于萃取不完全，乙二胺四乙酸二钠峰受其他组分干扰严重。注射液中一些组分保留在色谱柱中不能被洗脱，在批量连续测定时柱效迅速下降(图2)，为准确定量带来困难。本文优化了流动相，采用梯度洗脱，建立了一种能准确、方便测定该注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的高效液相色谱方法，为该药质量控制提供科学依据。1仪器与试药Aglient1100高效液相色谱仪(美国)；XS205电子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；PYA512精密pH计(德国赛多利斯公司)。丙泊酚注射液由阿斯利康制药有限公司提供，批号:GL944、GL945、GL947、GM745。乙二胺四乙酸二钠对照品(批号:L0D405，纯度为100.0%)购自USP，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。2溶液的制备2.1对照品溶液取乙二胺四乙酸二钠对照品适量，精密称定，用水制成500gmL1的溶液。精密685药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，31(3)*通讯作者，Tel:(86021)50798193，Email:lejian2002hotmailcom书书书量取该溶液1mL，置50mL离心管中，加空白丙泊酚注射液(不含乙二胺四乙酸二钠)9.0mL，混合均匀。精密加混合液异丙醇正庚烷(82)10mL，振摇1min，加入25mL正庚烷，振摇1min，4000rmin1离心10min，精密量取取下层溶液5mL，置10mL量瓶中，加入1.0mL0.08%CuCl2溶液，加水至刻度，精密量取50L，注入液相色谱仪，记录色谱图。2.2供试品溶液精密量取丙泊酚注射液10mL，置50mL离心管中，按“2.1”项下自“精密加混合液”起同法操作。3色谱条件和系统适用性色谱柱为PhenomenexLunaC18(100mm4.6mm，5m)流动相A为0.66%氢氧化铵溶液乙腈(31)(用磷酸调pH至6.5)，B为水甲醇(19)，洗脱顺序如表1，流速为1.0mLmin1；检测波长为260nm，进样体积为50L。理论板数按乙二胺四乙酸二钠计算不得低于3000。表1梯度洗脱顺序Tab1Gradientelutioninturn时间(time)/minA/%B/%01000610006.501001601004方法学研究4.1专属性试验精密量取空白丙泊酚注射液10mL，按“2.2供试品溶液”项下同法操作，记录色谱图。空白注射液、对照品溶液和供试品溶液图谱如图1所示，结果表明乙二胺四乙酸二钠峰不受其它组分干扰。图1空白注射液(A)、对照品(B)、供试品(C)HPLC色谱图Fig1HPLCchromatogramsofblankinjection(A)，EDTANa2refer-encesubstance(B)，andpropofolinjection(C)1乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)4.2线性关系取乙二胺四乙酸二钠对照品50mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，分别量取储备液2.0，3.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL，置10mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别量取精密量取1.0mL，同“2.1对照品溶液”操作。以乙二胺四乙酸二钠浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:A=9.831C+7.135r=0.99993结果表明，进样浓度为2080gmL1范围内线性关系良好。4.3定量限取乙二胺四乙酸二钠对照品溶液，逐级稀释，各精密量取1mL，同“2.1对照品溶液”操作，记录色谱图，以信噪比为101时的浓度作为定量限，结果表明定量限为10gmL1。4.4精密度试验取“2.2”中对照品溶液，连续进样6次，RSD为1.0%，表明进样精密度良好。取同一批号丙泊酚注射液(批号:GL944)按“2.2供试品溶液”项下测定乙二胺四乙酸二钠的含量，共6份，含量测定结果的平均值为0.004852%(W/V)，RSD为0.8%(n=6)，表明本方法重复性良好。4.5回收率试验精密称取乙二胺四乙酸二钠对照品适量，分别为处方量的80%，100%，120%投料，按“2.2”项下测定方法制备样品溶液，每个浓度测定3份样品，计算平均回收率。结果低、中、高3种浓度的平均回收率分别为100.7%，100.5%，100.7%。4.6稳定性试验取“4.5”项下的供试品溶液，分别于0，1，8，20h测定乙二胺四乙酸二钠峰面积，计算峰面积的变化程度。结果乙二胺四乙酸二钠的峰面积RSD为0.4%，表明乙二胺四乙酸二钠溶液在室温条件下20h内稳定。4.7耐用性试验分别改变流动相A的pH为6.0，7.0，其他条件不变。测定“4.5”中注射液乙二胺四乙酸二钠含量，分别为0.004869%，0.004841%。在pH为6.0时乙二胺四乙酸二钠保留时间减少，峰展宽，柱效下降。保持色谱条件不变，更换色谱柱，分别用KromasilKR1005(150mm4.6mm，5m)、WatersSpherisorbR5ODS2(150mm4.6mm，5m)，按“4.5”测定。结果分别为0.004860%，0.004871%，表明方法耐用性好。785药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，31(3)5含量测定按“2.2供试品溶液”测定3个不同批号丙泊酚注射液(批号分别为:GL945、GL947、GM745)，乙二胺四乙酸二钠含量别为0.004712%，0.004821%，0.004858%。6讨论流动相A中，四丁基氢氧化铵是离子对试剂2，四丁铵基与EDTA合铜离子结合成中性离子对，保留于C18固定相。反应如下:Cu(EDTA)2+2(C4H9)4N+(C4H9)4N2Cu(EDTA)。当pH降低，H+浓度升高，与(C4H9)4N+竞争和Cu(EDTA)2结合，离子对作用减弱，峰形变差，保留时间减少。但过高的pH会损害色谱柱和液相系统，所以pH6.57.0为最佳条件。目前，进口药品注册标准采用乙腈异丙醇四丁基氢氧化铵溶液三元体系为流动相，等度洗脱，该法测定受辅料干扰严重，在连续测定时柱效下降，峰形进一步变差。其原因是注射液中未提取完全的脂肪酸以及其他成分保留于色谱柱中，不能被洗脱。本文采用梯度洗脱，乙二胺四乙酸二钠于6min前出峰，洗脱液的是流动相A。其组成是四丁基氢氧化铵乙腈二元体系，乙二胺四乙酸二钠呈良好峰形，不受干扰。乙二胺四乙酸二钠出峰后，切换至流动相B，其组成是甲醇水(91)，洗脱能力较强，能使注射液中保留于色谱柱中的成分洗脱出来，避免柱效恶化，使连续的批量测定成为可能。取“4.5”中供试品溶液，色谱条件改为流动相A等度洗脱，洗脱时间10min。连续进样10次后，乙二胺四乙酸二钠峰严重前拖尾，柱效下降，如图2(A)所示。按本文梯度洗脱，连续测定30h，峰形依然良好，柱效未改变，图谱如图2(B)所示。图2等度洗脱10次进样后供试品色谱图(A)、梯度洗脱30h连续进样后供试品色谱图Fig2HPLCchromatogramsofpropofolinjectionafter10timesinjectionsusingisogradientmobilephase(A)andpropofolinjectionafter30hourbygradientelution(B)1乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)7结论本文建立了一种准确、方便测定丙泊酚注射中乙二胺四乙酸二钠含量的HPLC法。优化了流动相使乙二胺四乙酸二钠峰不受辅料干扰。梯度洗脱使注射液中其他组分不残留于色谱柱中，保持了柱效，能连续批量地进行测定。参考文献1YETiehu(叶铁虎)，LUOAilun(罗爱伦)IntravenousAnes