基因多态性及DNA甲基化在婴儿痉挛症发病机制的作用

分类号：R725 密级： 基因多态性及DNA甲基化在婴儿 痉挛症发病机制的作用 The role of genetic polymorphism and DNA methylation in the pathogenesis of infantile spasms 作者姓名：杨 光 学科专业：儿科学 导 师：邹丽萍 教授 答辩委员会主席： 教授 论文答辩日期：二一二年六月三日 院校地址：北京市复兴路28号 邮政编码：100853 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人 声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我院或其 他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究做出贡献的个人或集体 ，均已在文中作了明确的说明并表示感谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 指导老师签名： 日期： 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果 时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、 扫描或其他手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外） 。 论文作者签名： 日期： 指导老师签名： 日期： 军医进修学院博士学位论文 本研究由国家自然科学基金项目（编号 30770747、 30801249、81071036 和 81211140048） ，北京市自然科学基金项目（编号 7081002和 7042024）和 卫生部卫生行业科研专项课题项目（编号 200802074）所资助。 军医进修学院博士学位论文 目 录 第一部分 NR3C1 基因多态性与中国儿童婴儿痉挛症相关性的研究 中英文摘要 1 前言 3 材料和方法 5 结果 15 讨论 22 结论 25 参考文献 26 第二部分 CRHR1 基因多态性与中国儿童婴儿痉挛症相关性的研究 中英文摘要 31 前言 33 材料和方法 34 结果 42 讨论 48 结论 50 参考文献 51 第三部分 外周血 DNA 整体甲基化水平与中国儿童婴儿痉挛症相关性的研究 中英文摘要 54 前言 56 材料和方法 58 结果 63 军医进修学院博士学位论文 讨论 66 结论 68 参考文献 69 综述一：婴儿痉挛症发病机制的研究进展 72 参考文献 77 综述二：癫痫的表观遗传学研究进展 80 参考文献 85 攻读学位期间发表论文情况 88 个人简历 89 致谢 90 军医进修学院博士学位论文 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 5-mC 5-methylcytosine 5-甲基胞嘧啶 ACTH Adrenocorticotropic hormone 促肾上腺皮质激素 ARX Aristaless-related homeobox gene 无芒相关同源盒基因 BDNF Brain derived neurotrophic facor 脑源性神经营养因子 bp Base pair 碱基对 cAMP Cyclic adenosine monophosphate 环磷酸腺苷 CDKL5 Cyclin-dependent kinase-like 5 gene细胞周期依赖性激酶样 5 蛋白基因 CHB Han Chinese in Beijing 中国北京汉族人群 CI Confidence interval 可信区间 CNS Central neuronal system 中枢神经系统 CREB Response element binding protein 反应元件结合蛋白 CRH Corticotrophin releasing hormone 促肾上腺皮质激素释放激素 CRHR1 Corticotrophin releasing hormone receptor 1 促肾上腺皮质激素释放激素受体 1 CT Computed Tomography 计算机断层扫描 dNTPs Deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核苷酸 EEG Electroencephalograph 脑电图 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 ERP Event-related potential 事件相关电位 FMRP Fragile X mental retardation protein 脆性 X 智力低下蛋白 GABA -aminobutyric acid -氨基丁酸 GC Glucocorticoid 糖皮质激素 GluR2 Glutamate Receptor 2 谷氨酸受体 2 GR Glucocorticoid reccptor 糖皮质激素受体 HAT Histone acetyltransferase 组蛋白乙酰基转移酶 HDACs Histone deacetylases 组蛋白去乙酰化酶 HPA axis Hypothalamic-pituitary-adrenal axis 下丘脑 -垂体 -肾上腺轴 军医进修学院博士学位论文 HWE Hardy-Weinberg equilibrium 哈迪 -温伯格平衡 IS Infantile spasms 婴儿痉挛症 ISSX X-linked infantile spasms X-连锁婴儿痉挛症 LD Linkage disequilibrium 连锁不平衡 MAPK Mitogen-activated protein kinase 丝裂原活化蛋白激酶 MC2R Melanocortin 2 receptor 黑皮质素 -2 受体 MeCP2 Methyl CpG binding protein 2 甲基化 -CpG-结合蛋白 2 MRI Magnetic resonance imaging 磁共振成像 NKB Neurokinin B 神经激肽 B NMDA N-Methyl-D-aspartic acid N-甲基 -D-天冬氨酸 NPY Neuropeptide Y 神经肽 Y mRNA Messenger RNA 信使 RNA miRNA MicroRNA 微小 RNA NR3C1 Nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 糖皮质激素受体基因 OD Optical density 光密度 OR Odds ratio 比值比 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 R2 Coefficient of determination 确定系数 SAP Shrimp Alkaline Phosphatase 虾碱性磷酸酶 SD Standard deviation 标准差 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 siRNA Small interfering RNA 小干涉 RNA SNaPshot Single-base extension method 单碱基延伸 SNP 分型技术 SNP Single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 STK9 Serine-threonine kinase 9 丝氨酸 -苏氨酸激酶 9 Tm Melting temperature 解链温度 TSC Tuberous sclerosis complex 结节性硬化症 UTR Untranslated region 非翻译区 VGB Vigabatrin 氨己烯酸 军医进修学院博士学位论文 1第一部分 NR3C1 基因多态性与中国儿童 婴儿痉挛症相关性的研究 中文摘要 目的：婴儿痉挛症是年龄特异性的婴儿癫痫性脑病，以痉挛发作、脑电图高峰失律和精神运动发育落后为主要特征，50-88%的病人对促肾上腺皮质激素（ACTH）治疗有效。母孕期应激和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能失调与婴儿痉挛症发病明显相关。本研究选取HPA轴上的关键基因糖皮质激素受体的编码基因NR3C1作为候选基因，研究其与婴儿痉挛症发病及ACTH疗效的相关性。 方法：采用SNaPshot技术对128例婴儿痉挛症患者和131例正常对照的NR3C1基因的9个SNP位点进行了基因分型，分析病例组和对照组NR3C1的基因型及构建的单体型的频率分布差异，并分析在接受ACTH治疗的患儿中NR3C1基因多态性与ACTH疗效反应性的关系。 结果：在显性遗传模型下，经过年龄和性别校正后，rs10482672和rs2963155具有增加婴儿痉挛症发病易感性的作用（rs10482672基因型CT+TT的P值=0.018，OR=1.89，95% CI=1.11-3.22；rs2963155基因型CT+CC的P值=0.04，OR=1.70，95% CI =1.03-2.81）。rs6877893和rs4912905构建的单体型TG可降低婴儿痉挛症患病风险性（P=0.038，OR=0.66，95% CI=0.45-0.98），而携带TC单体型的纯合子病例发病风险增高（P=0.015，OR=2.60，95% CI=1.20 5.60）。研究还发现，携带rs6877893的TC基因型的病例ACTH反应性减低（P=0.047，OR=2.56，95% CI=1.01-6.50）。 结论：NR3C1基因多态性与中国人群的婴儿痉挛症易感性及ACTH反应性相关联。 关键词：婴儿痉挛症；基因；单核苷酸多态性；糖皮质激素受体；应激 军医进修学院博士学位论文 2Part I: Gene polymorphism of NR3C1 for genetic susceptibility to infantile spasms in a Chinese population Abstract Objective: Infantile spasms (IS) are a kind of age-specific disease that occurs in infancy, which is difficult to control with conventional anti-epileptic drugs. The pathophysiology of infantile spasms remains unclear. Prenatal stress and dysfunction of HPA axis have involved in the pathogenesis of infantile spasms. We select NR3C1 gene which encode the glucocorticoid receptor as candidate gene to investigate its association with IS. Methods: 128 cases and 131 controls were recruited and 9 single nucleotide polymorphisms (SNPs) of NR3C1 gene were genotyped by SNaPshot technique. Asscociation analysis was performed on the genotyped data. Results: Two SNPs, rs10482672 and rs2963155, showed nominal associations with IS (P=0.018, OR=1.89, 95% CI=1.11-3.22, for rs10482672； P=0.04, OR=1.70, 95% CI=1.03-2.81 for rs2963155) under the assumption of a dominant model. The haplotype TG of two SNPs (rs6877893 and rs4912905) was associated with a decreased risk of IS (P=0.038, OR=0.66, 95% CI=0.45-0.98), whereas haplotype TC being homozygous was associated with an increased risk of IS (P=0.015, OR=2.60, 95% CI=1.20-5.60). The rs6866893 were also associated with the responsiveness of adrenocorticotropic hormone (P=0.047， OR=2.56， 95% CI=1.