（应用化学专业论文）含天冬氨酸残基肽链水解断裂机理的研究.pdf

9，_。l，fi譬11 s t u d yo nh y d r o l y s i sc l e a v a g em e c h a n i s m o f p e p t i d e w i t h a s p a r t i ca c i d r e s i d u e b y z h a oy o n g - p i n g u n d e rt h es u p e r v i s i o no f p r o f a ih o n g - q i at h e s i ss u b m i t t e dt ot h eu n i v e r s i t yo fj i n a n i np a r t i a lf u l f f i l m e n to f t h er e q u i r e m e n t s f o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e u n i v e r s i t yo fj i n a n j i n a n ，s h a n d o n g ，p r c h i n a m a y2 5 ，2 0 1 1 忡32肌7俐3 舢8肿8iiiiiy 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：趁自! 垩 e t期： 趁f f 。三。2 主 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复 制手段保存论文和汇编本学位论文。 论文作者签名：嫠盘生导师签名： 济南大学硕士学位论文 目录 摘要。i u a b s t r a c t v 第一章绪论。1 1 1 概述1 1 2 方法6 1 2 1 计算机制的选择6 1 2 2 计算方法的选择9 第二章非极性脂肪族氨基酸的水解断裂1 1 2 1 气相中非极性脂肪族氨基酸的水解断裂一1 2 2 1 1 气相中非极性脂肪族氨基酸水解断裂的决速步骤分析1 2 2 1 2 气相中非极性脂肪族氨基酸环化后加水发生断裂的分析1 5 2 2 溶剂中非极性脂肪族短肽的水解断裂1 6 2 2 1 水溶剂溶剂对短肽水解断裂的影响。1 7 2 2 2 乙醇溶剂溶剂对短肽水解断裂的影响。1 8 2 3 本章小结1 9 第三章r 基不带电荷氨基酸的水解断裂情况2 1 3 1 气相中r 基不带电荷短肽的水解断裂2 4 3 1 1 气相中r 基不带电荷短肽水解断裂的决速步骤分析2 4 3 1 2 气相中非极性氨基酸与r 基不带电荷短肽决速步骤所需能量比较2 5 3 1 3 气相中r 基不带电荷短肽环化后加水发生断裂的分析2 6 3 2 溶剂中r 基不带电荷短肽的水解断裂2 7 3 2 1 水溶剂水r 基不带电荷短肽水解断裂的影响2 7 3 2 2 乙醇溶剂水r 基不带电荷短肽水解断裂的影响2 8 3 3 本章小结2 9 第四章芳香族氨基酸肽链的水解断裂3 1 4 1 气相中含芳香族氨基酸残基短肽的水解断裂3 3 4 1 1 气相中含芳香族短肽水解断裂的决速步骤分析3 3 4 1 2 气相中含芳香族短肽环化后加水发生断裂的分析3 4 4 1 3 气相中d a l 、d s d l 和d f d l 决速步骤所需能量比较3 5 4 2 溶剂中含芳香族氨基酸残基短肽的水解断裂3 5 4 2 1 水溶剂水对含芳香族短肽水解断裂的影响3 5 4 2 2 乙醇溶剂水对含芳香族短肽水解断裂的影响3 6 4 3 本章小结。3 7 第五章r 基带正电荷氨基酸残基短肽的水解断裂3 9 5 1 气相中r 基带正电荷氨基酸残基短肽的水解断裂4 0 5 1 1 气相中r 基带正电荷短肽水解断裂的决速步骤分析4 0 5 1 2 气相中r 基带正电荷短肽环化后加水发生断裂的分析4 1 5 2 溶剂中r 基带正电荷氨基酸残基短肽的水解断裂4 2 5 2 1 水溶剂对r 基带正电荷短肽水解断裂的影响4 2 5 2 1 乙醇溶剂对r 基带正电荷短肽水解断裂的影响4 3 5 3 本章小结一4 3 第六章含天冬氨酸残基短肽氮末端的水解断裂4 5 第七章结论及展望4 7 参考文献j 。j 4 9 致谢5 7 附录。5 9 一、在校期间发表的学术论文5 9 二、在校期间参加的项目5 9 济南人学硕l ：学位论文 摘要 本文在b 3 l y p 6 3 1 + g * 水平上模拟计算了十五种氨基酸与天冬氨酸组成短 肽的水解断裂的过程，共计算了6 8 种短肽异构体，发现只有2 9 种短肽异构体可 以发生水解断裂。对这些可发生水解断裂的短肽异构体中决速步骤( 环化) 活化 能最低的异构体，本文又用m 0 6 2 x 方法进行了验证，并用c p c m 溶剂模型讨 论了水溶液和乙醇溶液对这些短肽水解断裂所需能量的影响。究表明：在气相中， b 3 l y p 和m 0 6 2 x 两种方法所得结果一致，从而也证实所选方法的可靠性。 气相中，所有短肽水解断裂的决速步骤都为形成五元环的过程，而环化后加 水发生断裂所需的能量都较小，而左手a 螺旋构型比相应的右手0 l 一螺旋构型异构 体环化所需的活化能高。含非极性氨基酸残基的短肽环化时所需活化能顺序为： d g l d a l d m l d v d d l d l d i d 2 ，发现随侧链的增长环化所需的活化能逐渐变 低。环化后加水，在五元环异侧时肽链断裂所需的能量比在同侧加水所需能量要 低，女h d m d - s y n 4 ( 1 9 8k j - m o l j ) d m d - s y n 2 ( 1 5 3 k j m o l 1 ) 。在水溶剂中，受 溶质溶剂效应的影响，其环化所需能量变为：d i m d v d d l d l d m l d g l d a l 。在乙醇中，d l d l 、d m l 的溶质溶剂作用值为6 4 和- 4 9k j m o l ，两者的溶 剂作用差值为1 5k j m o l ，而水溶剂中两者的溶剂作用差值仅为0 2k j m o l ， 由于溶剂的不同导致了其溶质溶剂效应值的不同，从而引起了乙醇溶剂中d l d l 和d m l 环化所需的活化能大小发生了颠倒，其顺序变为d i d 2 d v d d m l d l d l d g l d a l 。在溶剂中环化加水后肽键断裂所需的能量受溶质溶剂效应的影响也 发生了变化。 在气相中，含r 不带电荷氨基酸残基的短肽环化所需能量大d , j q 页序为d s d l ( 2 3 4k j m o l 1 ) d c d l ( 2 2 2k j - m o l 1 ) d t d l ( 1 9 0k j m o l 。1 ) ，与含非极性氨 基酸残基肽链环化所需能量规律一致，都随侧链增长而降低；与上述一样，环化 后加水越多断裂所需的能量越高。受溶剂溶质作用的影响，在水溶剂中，三短肽 环化所需能量大小顺序变为：d c d l ( 2 3 4k j - m o l 。1 ) d s d l ( 2 0 6k j - m o l 。1 ) d t d i ( 1 2 5k j m o l j ) ；与水溶剂中环化能量顺序一致，只是相应能量变为：2 5 3 k j m o l 、1 9 4k j n n o l 、( 8 9k j m o l d ) ；不同的是，在水溶剂中，其溶质溶剂作 用值有利于活化能的降低，而在乙醇中，溶剂效应不利于能量的降低使其活化能 i i i 含天冬氨酸残基肽链水解断裂机理的研究 和产物能量都比气相中高 含芳香族氨基酸残基的短肽在气相中环化时所需要的能量大小顺序为： d y d l ( 2 3 3k j - m o l 。1 ) d f d l ( 2 2 8k j m o l 。1 ) d p d ( 1 9 7k j m o l 1 ) ，在水溶剂 中d f d l 的溶质溶剂作用比d y d l 强0 3k j - r n o l 一，正是因为这o 3k j n n o l 。1 的不同 使得d f d l 和d y d l 环化所需能量顺序变为d f d l ( 2 2 5k j m o l 0 ) d y d l ( 2 2 1 ) d p d ( 1 7 5k j m o l 。1 ) ；而在乙醇溶剂中，其d y d l 的溶质溶剂作用大于d f d l ， 因此环化所需能量大小顺序与气相中一致：d y d l ( 2 2 0k j m o l 。) d f d l ( 2 0 9 k j m o l 1 ) d p d ( 1 7 3k j m o l 。1 ) 。 含带一个正电荷氨基酸残基的短肽在气相中环化所需能量大小顺序为d h l ( 2 6 0k j m o l 1 ) d r d ( 2 5 4k j m o l 。1 ) d k d ( 2 1 8k j m o l 。1 ) ，由于d r d 和d k d 在环化后加水较多，只得到肽键断裂后的产物而未优化出其过渡态。在水溶剂中， d r d 、d k d 和d h l 环化形成五元环时溶质溶剂作用值分别为：4 8 、6 8 、1 5 7 k j - m o l ，较前三类短肽的溶剂作用都要强，这也使其环化所需能量大小顺序变 为：d r d ( 2 0 1k j m o l 。1 ) d k d ( 1 4 5k j m o l 1 ) d h l ( 1 2 8k j n n o l 0 ) ；在乙醇 溶剂中，d r d 、d k d 和d h l 环化形成五元环时溶质溶剂作用值分别为：6 2 、8 0 、 1 1 9k j m o l ，强的溶质溶剂作用值使其环化所需能量大小顺序变为：d r d ( 1 9 0 k j m o l 。1 ) d h l ( 1 4 2k j m o l 一) d k d ( 1 2 6k j m o l 。1 ) 。 关键词：天冬氨酸；水解断裂；c p c m 模型；溶剂效应 i v 济南大学硕卜学位论文 a b s t r a c t t h ec l e a v a g em e c h a n i s mo ff i f t e e nk i n d sp e p t i d e sc o n t a i n i n ga s p a r t i ca c i di n s o l v e n tp h a s ew a ss t u d i e da tt h eb 3 l y p 6 - 31 + g 木l e v e l 6 8k i n d so fp e p t i d e sw e r e s i m u l a t e d ，o n l y2 9k i n d sc o u l dh a p p e nc l e a v a g ei ns o l v e n tp h a s eh o w e v e r t h o s e i s o m e r sw i t hl e a s ta c t i v a t i o ne n e r g yi nt h e i rr a t e - l i m i t i n gs t e pw e r ef u r t h e rv e r i f i e db y m 0 6 2 xm e t h o d ；m e a n w h i l et h es o l v e n te f f c ti nt h ew a t e ra n de t h a n o la r ec o m p a r e d b ye m p l o y i n gt h ec p c mm e t h o d t h er e s u l ts h o w st h a tt h eg a s p h a s ed a t af r o mt h e b 3l y pm e t h o dw a si ng o o da g r e e m e n tw i t ht h o s ef r o mm 0 6 2 xm e t h o d ，c o n f i r m i n g t h er e a s o n a l i t yo ft h em e t h o ds e l e c t e d t h er a t e l i m i t i n gs t e pw a st h ec y c l i z a t i o no n ei na l lc l e a v a g e p r o c e s sf o ra l lt h e s e p e p t i d e si ng a sp h a s e ；t h ea c t i v a t i o ne n e r g yb a r r i e ro ft h es e c o n ds t e pw a sl o w e rt h a n t h ef i r s to n e t h ep e p t i d e sw i t hl e f t h a n da - h e l i xc o n f i g u r a t i o nn e e dl o w e ra c t i v a t i o n b a r r i e rt h a nt h a tw i mr i g h t - h a n da - h e l i xo n ei nt h er a t e - l i m i t i n gs t e po f c l e a v a g e t h e a c t i v a t i o ne n e r g yo r d e ro ft h er a t e l i m i t i n gs t e po f p e p t i d e sc o n t a i n e dn o n p o l a ra m i n o a c i di s d g l d a l d m l d v d d l m d i m m o r e o v e r , t h ea c t i v a t i o ne n e r g yo f r a t e - l i m i t i n gs t e po fc l e a v a g eb e c o m e sh i g h e ra l o n gw i t ht h es i d ec h a i ni n c r e a s i n g a f t e rt h ec y c l i z a t i o ns t e p t h ee n e r g yi sl o w e rf o rt h ec o m p l e x e sw i t hh y d r a t i o na tt h e s a m es i d et h a nf o rt h o s e 砸t hh y d r a t i o na td i f f e r e n t s i d e s ，i e ，d m o s y n 4 ( 19 8 k j m o l ) d m o - s y n 2 ( 15 3 e l n n o l 。1 ) t h es o l w e n te f f e c ta f f e c tt h eo r d e ro fa c t i v a t i o n e n e r g yo fc y c l i z a t i o ns t e pi nt h ew a t e r , a n dm a k et h e mb e c o m ed i m d v d d l m d m l d g l d a l t h es o l v e n t - s o l u t ei n t e r a c t i o ne n e r g i e so fd l m a n dd m l w e r e 一6 4 a n d - 4 9k j m o l i ne t h a n a l ，r e s p e c t i v e l y t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e mi s 1 5 k j m o l ，i nw a t e rt h ed i f f e r e n c ei s 0 2k j , m o l 1h o w e v e r t h ed i f f e r e n ts o l v e n t sb r i n g o nd i f f e r e n ts o l v e n te f f e c t t h ee n e r g yo r d e ro fc y c l i z a t i o ns t e pb e c o m e sd i m d v o d m l d l d i d g l d a li ne n t h a n 0 1 t h ee n e r g yo ft h es e c o n ds t e p ( c l e a v a g eo f p e p t i d e ) a l s ow a sa f f e c tb yt h es o l v e n t i ng a sp h a s e ，t h eo r d e ro ft h ea c t i v a t i o ne n e r g yo f c y c l i z a t i o ns t e po fp e p t i d e s c o n t a i n e d c h a r g e d s i d ec h a i ni s d s d l ( 2 3 4u m o l 1 ) d c d l ( 2 2 2k j t o o l 1 ) v 含天冬氨睃残幕肽链水解断裂机理的研究 d t m ( 1 9 0k j m o l 1 ) ，t h e yh a v es a m eo r d e r i n ga st h o s ep e p t i d e sw i t hn o n p o l a r i t y a m i n oa c i d n a m e l y , t h ea c t i v a t i o ne n e r g yo fr a t e - l i m i t i n gs t e po fc l e a v a g eb e c o m e s h i g h e rw i t ht h es i d ec h a i ni n c r e a s i n g a sm e n t i o n e da b o v e ，t h em o r eo fw a t e ri s a t t a c h e d ，t h eh i g h e ro fc l e a v a g ee n e r g yo fp e p t i d e si sn e e d e da f t e rc y c l i z a t i o n i n w a t e rs o l v e n t ，t h ee n e r g yn e e d e df o rc y c l i z a f i o ni nt h et h r e es h o r tp e p t i d e ss e q u e n c e o f b e c o m e sd c d l ( 2 3 4k j - m o l 一1 ) d s d l ( 2 0 6k j m o l 1 ) d t d l ( 1 2 5k j m o l 1 ) b yt h e s o l v e n te f f e c t s i ne t h a n a l ，t h eo r d e ri ss a m ea st h a ti nw a t e ra n dt h ec o r r e s p o n d i n g e n e r g yb e c o m e s2 5 3 、19 4 、8 9k j m o l t h ea q u e o u se f f e c tl e a dt ot h ed e c l i n eo ft h e a c t i v a t i o ne n e r g yo f r a t e - l i m i t i n gs t e p ，e t h a n a le f f e c td o e sn o th o w e v e r t h ee n e r g yo r d e ro fa r o m a t i cp e p t i d e sn e e d e df o rc y c l i z a t i o ni sd y d l ( 2 3 3 k j m o l 。1 ) d f d l ( 2 2 81 0 m o l 。1 ) d p d ( 19 7k j m o l 。1 ) i ng a sp h a s e i na q u e o u sp h a s e , t h es o l v e n te f f e c to fd f d li ss t r o n g e rt h a nt h a to fd y d lb y0 3k j m o l a sar e s u l t ， t h ee n e r g yo r d e ro fc y c l i z a t i o nb e c o m ed f d i ( 2 2 5k j m o l 。1 ) d y d l ( 2 2 1l d m o l 。1 ) d p d ( 1 7 5k j m o l 一1 ) i ne t h a n o l ，t h es o l v e n te f f e c to fd y d li sh i g h e rt h a nt h a to fd f d l t h ee n e r g yo r d e ri sd y d l ( 2 2 0k j - t o o l 1 ) d f d l ( 2 0 9l d m o l 。) d p d ( 17 3 k j m o l 1 ) ， w k i c hi st h es a m ea st h a ti nt h eg a sp h a s e i nt h eg a sp h a s e , t h ea c t i v a t i o ne n e r g yo ft h ec y c l i z a t i o no fp o s i t i v e l yc h a r g e d p e p t i d e si sd h l ( 2 6 0k j n n o l 。1 ) d r d ( 2 5 4k j m o l 。1 ) d k d ( 2 1 8k j m o l 1 ) o n l yt h e p r o d u c tb u ts t r a n s i t i o ns t a t ea r eo b t a i n e ds i n c ed r da n dd k dn e e dm o r ew a t e rt o c l e a v a g ea f t e rc y c l i z a t i o n i na q u e o u sp h a s e ，t h es o l v e n t s o l u t ei n t e r a c t i o ne n e r g yo f d r o 、d k da n dd h li nt h ef i r s ts t e pi s - 4 8 、6 8 、15 7k j m o l ，r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n gs t r o n gs o l v e n te f f e c tb yc o m p a r i n gw i t ht h ep r e v i o u st h r e ep e p t i d e s t h e a c t i v a t i o ne n e r g yo r d e ro fc y c l i z a t i o nb e c o m e sd r d ( 2 0 1k j - r n o l 一) d k d ( 1 4 5 k j m o l ) d h l ( 1 2 8k j n n o l 一1 ) i ne t h a n o l ，t h es o l u t e - s o l v e n te f f e c tv a l u e so fd r d 、 d k da n dd h l i nt h ef i r s ts t e pa r e 6 2 、8 0 、11 9k j - m o l 一，r e s p e c t i v e l y s u c ha s t r o n g e ri n t e r a c t i o nr e s u l t i nt h ea c t i v a t i o ne n e r g yo r d e rt o b e c o m e ：d r d ( 1 9 0 k j m o l 1 ) d h l 0 4 2k j m o l 。1 ) d k d ( 1 2 6k j m o l 1 ) k e yw o r d s ：a s p a r t i ca c i d ；h y d r o l y t i cc l e a v a g e ；c p c m ；s o l v e n te f f e v i 1 1 概述 第一章绪论 众所周知蛋白质做为潜在药物，其可用性远远大于化学小分子，由于他们的 空间构型以及化学性质等易受外界的影响，其功能性质也极易受到影响【l 】，任何 结构的改变都可能影响治疗效能以及免疫能效【2 5 】。因此，对其断裂降解的研究 显得尤为重要。然而，大量的实验发现大部分肽链的断裂发生在天冬氨酸或谷氨 酰胺前后。 天冬氨酸可作为k + 、m g + 离子的载体向心肌输送电解质【6 】，从而改善心肌收 缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。在 生理条件下，天冬氨酸对蛋白质活性及其功能有着重要的影响【7 1 。在u d p 半乳糖 酶催化作用中，组氨酸3 1 5 和天冬氨酸3 1 6 有着很重要的作用，如若改变其位点或 将其替代【8 】，u d p 一半乳糖催化酶的活性就会受到影响，这与天冬氨酸上分布的负 电荷有关【9 。1 0 】，天冬氨酸上负电荷的分布使a s p 俱j 链羧基作为很好的亲核试剂进 攻肽键碳原子【l 。此外，在胶原蛋白中，天冬氨酸位置的改变或替代也可以引起 蛋白质序列中主链的局部扰动和性质的改变，它主要通过分子内结合水氢键的多 少来改变胶原蛋白的性质【1 2 - 1 3 1 。a n t h o n y 等t 1 4 】在核糖核酸酶中也发现了相似的现 象。因此对天冬氨酸的研究引起了人们广泛的兴趣。 近年来，大量实验发现，许多肽链在天冬氨酸残基前后会发生自发性的断裂。 a k k e r l l l a n $ 等人将p 一乳蛋白在p h2 溶液中加热后，在高效液相色谱中发现许多断 裂的肽链片段，而这些肽链片段多是在天冬氨酸残基前后断裂的【1 5 】。n i c o l a s 等 利用电离微波解离法，也发现胰岛素、乳蛋白、肌红蛋白和白蛋白中肽链的断裂 主要集中在天冬氨酸残基的碳末端1 7 1 。s h a r o nj 等人以牛遍在蛋白为研究对 象时，发现在天冬氨酸残基碳末端和脯氨酸残基氮末端都有断裂，并且其断裂与 肽链的电荷分布及质子转移情况有关。赖氨酸上的胍基( 碱性基团，在生理状态 下带负电荷) 可以有效的提高天冬氨酸碳末端断裂的速率【1 9 】。r a m a n 在研究天冬 氨酸在胶原蛋白中的作用时发现天冬氨酸二面角、氢键的改变都可以影响胶原蛋 白的功能性质【2 ，1 2 1 。l j u 等在研究大肠杆菌和c y n t h i a a k k e r m a n s 等发现在血管中 具有抗氧化作用，而改变了其构型后凝血素的抗氧化降低【2 0 1 。h i r o t a 等人在研 岔天冬氮簸残幂肽链水解断裂机理的珂f 冗 究细胞色素时发现，侧链带有负电荷的天冬氨酸可以作为电子的供体以完成血红 素辅基中铁原子的还原态( 二价铁离子) 和氧化态( 三价铁离子) 之间的可逆变化 【2 1 1 ，而天冬氨酸构型以及所带电荷的改变，都能使这种可逆变化终止，从而影响 整个生理过程的进行2 2 1 。这样的实验现象举不胜举 5 , 2 3 埘, 2 5 】。然而这些实验研究 主要集中于生理状态下，利用圆二色性【2 6 1 、离子碰撞诱导解离【2 7 1 、质谱、核磁 等网方法去识别断裂位点【2 明及推测断裂的途径。因此，实验与理论模拟的集合 相伴而来。 天冬氨酸( a s p ) 在体内由谷氨酸转氨给草酰乙酸而得，分解则通过脱氨基 生成草酰乙酸或经天冬氨酸酶的作用脱氨生成丁烯二酸c t a 循环【3 0 】。它是生物 体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体 1 4 , 3 1 】。在生理条件下，天冬氨酸不稳定，肽链或蛋白质在天冬氨酸残基锻前后的 断裂已被报道【4 ，6 ，1 4 ，3 2 。3 3 】，含天冬氨酸肽链的断裂机制也被广泛研究。许多含天 冬氨酸的肽链的断裂机制被提出和讨论，这一理论的研究主要涉及两种典型的短 肽即质子化的的肽链和未质子化的肽链，而大部分实验中对后者的研究较多。 上世纪，d o n g r e 和a s h o k 利用电镀离子化，研究了肽链的断裂影响因素【3 4 。3 5 1 ， g u 等人以寡肽x - l e u a s p v a l l e u - g i n ( x = a r g 、l y s 、h i s ) 为模型，并将这一系 列模型逐一质子化，利用串联质谱仪研究发现寡肽在天冬氨酸残基处选择性断 裂，并且由于气象中精氨酸的碱性而提高了其与天冬氨酸的断裂速度【3 6 1 。大量实 验发现，肽链的断裂和它所带有电荷及可游离的质子有兴2 3 , 3 7 】，当肽链中含有可 游离质子时，肽链发生非选择性断裂，而当没有可游离质子存在时发生选择性断 裂【l o ，3 8 1 。很多研究表明在a s p - x x x 模型中只有正电荷的数量不超过氨基酸残基 的数量时才会发生选择性断裂【”- 4 0 。在实验研究的同时，研究人员也对天冬氨酸 残基前后的水解断裂机制进行了大量的模拟计算。 寡肽断裂的理论模拟主要采用c h 3 c o - a s p n h c h 3 模型，提出了几种反应机 制及影响因素( 电荷分布、游离质子、侧链构型、蛋白质三维结构等) 【8 ，1 7 2 3 ，2 5 ， 3 6 , 4 2 - 4 3 】。人们对含天冬氨酸残基肽链( 此肽链为骨架质子化后的模型) 断裂的提 出了五种不同的反应机制如图1 1 【4 3 讲】。但a n j a l i 等在实验中发现a 、c 和d 的p h 速率曲线不一致，且在同位素标记实验中也没有发现同位素在限速过程中出现， 因此可以排除这三种机制【4 5 1 。e 与b 在p h 速率曲线中相一致，但e 中缺少离去基 2 济南大学硕 j 学位论丈 团的同位素标记，所以b 机制可能比较正确。 下一弋 , , v n t t 贮c i tz 舳i 删。c m i m ”删 堪l r b o 车o ) 一删 c o e 弋 ， 卅舰一严c i i - c 一阿二_ ：删v n h n h 州 。 皑计 e 冒 f o h f 扛r n n i t c i t 。c n h w 皑矿 n h n h o 以 n 哪一 o o o o + 1 1 3 n j 、 产 卅h n o o + h = i n m i i o 。 i i i e o h f 一伽+ 严o h + 缸o h p：照卅舳。飞俨山ovnf!chchb 墨i i 啊坩砷m l o 旨 冒 占一仃 尝一o f 一仃彳一仃ii _ c ! h 2 0 ! h 一严o h 衄占导 - 长严+ 以舳b 音啊 o n 6 图1 1 质子化肽键断裂的途径 f i g 1 1c l e a v a g ep a t h w a y so fp r o t o n t e dp e p t i d e s 3 含天冬氦酸残幕肽链水解断裂机理的研究 o o o o o o o o o o 仃 h 2 n 图1 2 未质子化肽链的断裂途径 f i g 1 2c l e a v a g e p a t h w a y so f u n p r o t o n t e x lp e p t i d e s p a i z s 等人则详细的阐述了非质子化肽链断裂的机制】，如图1 2 。质子化肽 链经碰撞诱导解离后，发现电离质子在断裂中起着重要的作用，并提出了游离质 子的模型【3 2 4 6 1 。y u 等人提出了盐桥中间体的机$ i j t 3 2 , 4 7 1 ，如图1 2 a 所示，天冬氨酸 侧链羧酸的羟基氢原子转移到酰胺氮上的同时羟基氧作为亲核试剂进攻主链羰 基，形成五元环同时肽键断裂。p r i c e 等 4 2 1 修改了1 的盐桥机制把质子化天冬氨 酸侧链的羧基也考虑进去，如图1 2 b ，他以精氨酸和天冬氨酸形成的二肽为模型， 研究了精氨酸对肽键断裂的影响，其断裂中形成了盐桥( + + ) ，但是这种机制 4 济南大学硕上学位论文 很难形成稳定的活性酰基离子产物，因此这种断裂途径没有被广泛采用，然而他 们意外的发现a s p p r o 肽键比所研究的其它二肽更容易断裂l o , 3 9 1 。以此，g u 等【2 3 】 提出了另一种断裂机制，如图1 2 c 所示，天冬氨酸侧链羟基氢原子转移到主链羰 基氧上的同时形成一个五元酸酐，然后氢质子再次发生转移至酰胺氮上同时发生 肽键断裂。而对质子化a 唱a s p n h 2 的研究则显示了另一种有利的断裂机制【4 8 】 ( 图1 2 d ) ，即侧链羟基氢原子转移到主链羰基的同时羟基氧进攻羰基碳，形成 五元环，肽键断裂，氨基离去。此外他们分析的二肽a r g - a s p 不可能存在于实验 室中也不可能存在于生理环境中被胰蛋白酶分解。尽管研究途径和a s p a r g 复合 物非常相似，由于途径e 需要另外官能团的引入，因此并没有被考虑。这些途径 有一个共同点那就是天冬氨酸残基侧链羧基氢原子的局部迁移。p a i z s 等利用最简 单的模型r d - n h 2 ( 此模型包含碱r 和酸d ) 从头计算了内部溶剂化和盐桥结构 的相对能，经串联质谱计电离激活后，内部溶剂化构型转变为盐桥构型，计算发 现盐桥构型并不是n h 3 离去的先决条件 4 9 1 。 s a r o n 等人已利用c h 3 c o - a s p n h c h 3 模型采用b 3 l y p 6 3 l + g 事，i 计算模拟了 二肽断裂的情况【5 0 】，并显示了断裂的途径( 图1 2 c ) ，即a s p 侧链羧基氢原子转移 到酰胺氧上环化形成五元环，再通过水分子将酰胺氧上的氢原子转移到酰胺氮 上，酰胺键断裂【4 3 ，5 。 主链质子化的反应途径倾向于图1 1 b 中的机sr j b ，而不含可移动质子的肽链 断裂更倾向与图1 2 中的机制c 。f m c o 等人【4 3 , 5 2 】高温加热含天冬氨酸的不同肽 链，提出了两种反应途径如图1 3 ，其碳末端断裂途径与g u 掣2 3 提出的断裂途径 相似，都是天冬氨酸的p 羧基作为质子供体，羟基氧原子作为亲核试剂进攻临近 的羰基，形成五元环酸酐，氢质子再次转移到酰胺氮上，而后发生肽链断裂。其 氮末端断裂途径则是天冬氨酸残基的b 羧基进攻其氮末端的羰基，形成六元环， 加水在天冬氨酸残基氮末端断裂。虽然在实验中并没有发现天冬氨酸氮末端的断 裂产物，这仅仅说明碳末端断裂在动力学上要比氮末端稳定【4 7 , 5 3 】。 目前对肽链断裂的研究主要集中高温加热使肽链发生断裂，再利用核磁、圆 二色性或串联质谱来研究其断裂的产物，根据断裂片段推测其断裂的途径。对含 天冬氨酸肽链碳末端( a s p - x x x ) ( x x x 代表侧链不同的氨基酸) 断裂的研究仅限 于c h 3 c o - a s p - n h c h 3 模型，而实验虽在肽链中发现在天冬氨酸残基处可以发生 5 含天冬氯酸残基肽链水解断裂机理的研究 肽键断裂，但相邻氨基酸侧链的不同对肽链断裂的影响规律及其断裂机理并未有 人进行研究计算，因此，本文将研究c h 3 c o a s p x x x n h c h 3 模型下侧链对短肽 水解断裂的影响规律，并找出各类氨基酸与天冬氨酸组成短肽的碳末端水解断裂 的规律。 虽然已有很多实验发现在天冬氨酸氮末端也有断裂发生，但对天冬氨酸氮末 端的断裂机理的研究却一致未被提及，本文也将利用c h 3 c o - x x x a s p - n h c h 3 这一模型对天冬氨酸氮末端水解断裂进行模拟，最终与天冬氨酸碳末端水解断裂 机理进行比较，找出各氨基酸与天冬氨酸组成短肽的最佳水解断裂途径。但由于 对天冬氨酸碳末端断裂的研究较多，因此本文将用四章的篇幅着重分析含天冬氨 酸短肽碳末端断裂的不同。天冬氨酸残基前后断裂的理论研究可以给蛋白质分 析、药物合成等工作人员提供一些含天冬氨酸残基的大分子物质的稳定构型，从 而推动药物学、蛋白质组学的进一步发展，研制更有效的药物。 1 2 方法 1 2 1 计算机制的选择 如前所述含天冬氨酸残基短肽的断裂机制已被多人研究，其中主要的几种断 裂机制在上文中己经叙述过，本文采用了研究较多的碳末端断裂机$ 1 t s o , s 4 - 5 5 1 ，即 在一份子水的条件下天冬氨酸侧链羧基羟基氢原子转移到肽键酰胺氧上，与此同 时形成中间体酸酐五元环，在形成五元环的基础上再结合几分子水，形成水链， 使得肽键酰胺氧上的氢原子通过水链转移到酰胺氮原子上，进而使得短肽肽键发 生水解断裂，如图1 3 a 。而氮末端断裂则采用了i 扫f r a n c o 掣4 1 , 5 6 】提出的断裂机理 如图1 3 b ，即在水分子存在的条件下天冬氨酸侧链羧基羟基氢原子转移到与之相 邻氨基酸的肽键酰胺氧上，与此同时形成中间体六元环，在形成六元环的基础上 结合几分子水，形成水链，使得肽键酰胺氧上的氢原子通过水链转移到酰胺氮原 子上，再在水分子的作用下酸酐键断裂，形成一分子含羧酸基的碳末端和一分子 含天冬氨酸的氮末端。 w e n 等人在研究d v 和a s p x x x 时也发现了在天冬氨酸残基处的断裂【8 】。a n j a l i 等在研究胰高血糖裂5 7 1 p d b ：i g c n h s q g t f t s d y s k y l d s r r a q d f v q w l m n t 时发现在a s p 一9 、a s p 1 5 ；g l a s p 2 1 等处有断裂片段【4 3 1 。c 灿i a 等【1 5 毛e p h2 0 6 济南人学硕l j 学位论文 加热条件下p 一乳球蛋白在d i ( 1