丹参鉴定学专论

11/22/2017,中药鉴定学专论,丹参分子生药研究,11/22/2017,一、丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别二、丹参分子基因组的分析及构建三、不同产地丹参分子生药基因组的分析四、高质量的丹参叶片DNA的提取方法研究,11/22/2017,第一部分：丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别。,11/22/2017,1丹参形态学鉴别,植物学特性鉴别传统方法大多根据丹参的形态方面对药材的真伪进行鉴别。丹参为多年生草本,根砖红色,茎高4080 cm,多分枝,被长柔毛。叶常为奇数羽状复叶。叶柄长17 cm,小叶37,顶端小叶较大。小叶卵形或椭圆状卵形。长1. 58 cm,宽0. 85cm,先端钝,边缘具圆锯齿,两面被柔毛,下面较密,花序顶生或腋生轮伞花序有花6至多花,组成假总状花序,密被腺毛及长柔毛;小苞片披针形;花萼钟状,长11. 3 cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠蓝紫色,二唇形,长22. 7 cm,花冠筒外伸,弯曲,上长达2 cm,筒内有毛环;雄蕊2,药隔长,花丝短,上臂药室发育, 2下臂的药室不育且联合;小坚果4,椭圆形,花期58月,果期89月。,11/22/2017,丹参形态,11/22/2017,丹参药材根部性状,丹参药材根部性状鉴别丹参及其亲缘种类的药用植物甚多,以根部特征区别各类丹参也是沿用很久的经典方法。丹参根的特征为:丹参多为带根茎的根,根茎粗短,有茎基残余,下着生多数细长的根。根呈圆柱形,稍弯曲,表面呈砖红色,粗糙,具多数纵沟或皱纹,有须根痕,外部栓皮常鳞片状剥落,皮层有时开裂,长822 cm,直径512 mm,质坚脆,易折断,断面不平,疏松有裂隙,皮部棕渴色或砖红色,韧皮部狭。形成层明显,淡棕色,木质部导管束灰黄色或黄白色,放射状排列。气微,味微苦、涩,以条粗壮、色紫红者为佳。,11/22/2017,丹参药材根部形态,11/22/2017,水试鉴别法：,用水浸泡丹参根的方法对丹参进行鉴别,正品丹参根浸泡后的溶液无色,药材稍膨胀,颜色稍微变浅。伪品丹参溶液显红色药材变为淡红色。水浸后续断会被染成红色,粉末中有草酸钙簇晶;丹参水浸不染成红色,粉末中无草酸钙簇晶,但有石细胞及红棕色物为丹参。从而将两者进行区分。,11/22/2017,显微结构鉴别,根的横切面显微结构鉴别 根粉末的显微结构鉴别花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别,11/22/2017,根的横切面显微结构鉴别,根据丹参横切面显微结构特征与紫丹参进行区分,丹参(Salvia miltiorrhizaBge. )木栓层37列,木栓细胞长方形,切向延长,壁非木化或微木化;外侧有时可见落皮层。皮层窄,纤维单个散在或26个成群,孔沟放射状,层纹细密。韧皮部较窄,由筛管群和薄壁细胞组成。形成层明显成环。木质部宽广, 412 mm呈放射状排列。有些相邻的束在内侧合并,导管类圆形或多角形,有的沿径向延长,直径1565 mm,单个散在或212个成群,径向排列或切向排列;木纤维发达,多成群分布于大导管周围;有的本质部束内有12群木化薄壁细胞;木射线宽广,射线细胞多木质化增厚。紫丹参根茎表皮细胞1列,内含紫红色物质;皮质薄壁细胞有的具纹孔;髓部薄壁细胞壁呈连珠状增厚或稍增厚,具纹孔。根本质部束常较小,导管也少。,11/22/2017,根粉末的显微结构鉴别,丹参粉末呈红棕色。木栓细胞黄棕色,表面观呈类方形或多角形,壁稍厚,胞腔内常含红棕色色素,色素溶解后,断面观细胞类长方形,排列较整齐。木纤维多成束,长梭形,纹孔斜裂缝状或十字状,孔沟稀。导管主要为网纹和具斜纹孔导管。石细胞呈类圆形、类三角形、类梭形、类长方形或不规则形,也有延长呈纤维状,有的胞腔内含棕色。,11/22/2017,花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别,一定的植物具有一定形态的花粉,因此花粉形态研究也是植物分类鉴别的依据之一。丹参的花粉以外壁较薄、纹饰网眼较浅、网脊较粗、沟较宽、沟底具颗粒而区别于其他种。,11/22/2017,理化学方法鉴别,根据丹参所含的化学成分进行鉴别经过大量分析研究说明丹参所含化学成分中二萜醌成分与系统发育有密切关系,二萜醌类化合物组成的不同可以作为种类鉴别的依据,根据二萜醌成分含量的多少对丹参组作丹参的药用植物的亲缘关系进行划分。,11/22/2017,薄层色谱鉴别,采用薄层色谱定性鉴别的方法比较后指出在同一展开系统的条件下,无论是野生还是栽培品种,丹参的一些主要成分相同,以此可以作为识别丹参药材真伪的参考依据。,11/22/2017,紫外吸收光谱鉴别,丹参在253, 277 nm两处有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248, 218, 203 nm 4处有吸收特征峰。作丹参使用的药材紫外吸收光谱的范围不同,据此可以对两者进行鉴别。丹参粉末处理后置紫外灯(365nm)下现察显亮蓝灰色荧光。,11/22/2017,指纹图谱鉴别(HPLC法),具有色谱稳定性好、柱效高、应用范围广等特点,是中药指纹图谱研究中常用的手段。对丹参等几种中药指纹图谱与代谢指纹图谱研究的结果,指出不同产地的药材在指纹图谱上存在较大差异。,11/22/2017,分子生物学鉴别方法,1RAPD鉴别法：随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术已经被广泛应用于物种鉴别。2DNA遗传标记技术随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,从遗传DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点,且不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响,已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景,并保持强劲的发展势。,11/22/2017,第二部分 丹参分子基因组的分析及构建,11/22/2017,1丹参主要居群DNA指纹图谱的建立2丹参EST序列中SSR信息的分析及建立,11/22/2017,丹参主要居群DNA指纹图谱的建立,基因组DNA的提取编号 名称 来源 花颜色Al 大叶丹参 四川中江 紫色A2 商洛丹参 陕西商洛 紫色A3 首县紫花丹参 山东芭县 紫色A4 四倍体丹参 中国药科大学 紫色A5 芭县白花丹参 山东芭县 紫色A6 北京丹参 中国中医药研究院 紫色A7 毫州丹参 安徽亳州 紫色A8 丙城丹参 山西茵城 紫色A9 江苏丹参 江苏射阳 紫色A10 小叶丹参 四川中江 紫色A11 安国丹参 河北安国 紫色A12 甘西鼠尾草 甘肃 紫色A13 一串红 陕西省杂交油菜研究中心 红色A14 油菜 陕西省杂交油菜研究中心 黄色A15 小麦 陕西省杂交油菜研究中心 注:Al一Al，为各居群编号，以下同。,11/22/2017,RAPD一PCR扩增反应体系及扩增程序的优化,别设计M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度等单因子试验，同时保持扩增体系的其它成分浓度及扩增程序其它环节不变，以优化、确证适宜的M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度。,11/22/2017,鉴别丹参与其近缘和远缘植物的特征引物及其DNA指纹图谱,引物s2035、s222扩增结果不仅稳定、条带明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指纹图谱丹参主产区的n个居群丹参的PCR扩增带型几乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七条共同的特异条带，即图6的条带Cl、CZ、C3、C4、图7的CS、C6、C7，各丹参居群完全相同。,11/22/2017,结果验证：结果验证显示，PCR扩增重复性较好，取样合理，能够代表各居群。,11/22/2017,丹参EST序列中SSR信息的分析及建立,丹参EST序列中SSR信息的分析 微卫星（Microsatellite）又称简单重复序列(Simplesequence repeat)，指的是基因组中由 16 个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段 DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在 200bp 以下SsR 分子标记具有数量丰富，多性高，多等位基因，共显性，重复性高等优点。根据建立 SSR 标记的序列性质不同可分为基因组 SSR （Genomic SSR,gSSR） 和表达序列标签 SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）。EST 及表达序列标签是通过从 cDNA 文库中随机挑选的克隆进行大规模测序所获得的 5或 3端序列，长度一般在 150500bp。,11/22/2017,丹参 EST-SSR 引物情况表,引物编号 重复基元 GeneBank EST 编号 预期产物bp 引物序列 退火温度（）,SSR001 (TACA)5 CV172410 241 GAGGCTACTTCGTGGAGG 52.3 GAAACTAAAGCAACAAACCC 52.1,SSR002 (CA)16 CV172134 176 CCGTGGTGTTCCCTCTTT 55 TGCCGATTCTAACCTGTATG 53.7SSR003 (CT)10 CV171877 137 AGAGGCTGCTGCTTCATT 52.7 TCAAGTCATAGGCGTGGC 54.5SSR004 (AAC)6 CV171649 222 AGGCAGACAGACCTCATA 46.7 CTTCCCACCAAATAACTC 46.8SSR005 (GTG)6 CV171565 153 CTCAGCACCTACTACCACAT 49.6 CTTATCCCAACACTTCTTCT 48.5SSR006 (ATC)5 CV171563 155 AAACAGAGCGACGAAGCAG 56.2,11/22/2017,ACCACCATCACTCAAGACG 56.4,SSR007 (CTT)11 FE537066 165 CTCCGCTTCGCTCCTCTT 57.7 TGCTCGCTTCGTCGTCTT 57.2SSR008 (GCT)6 FE536370 181 AGGTTACTACCGATGAAGCAG 54.1 AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT 53.2SSR009 (AAG)6 FE536230 145 GACTTTGGATGCCTGCTC 52.9 GACGCCGCTACTTTCTAT 50.2SSR010 (TATGC)5 FE536872 136 AATAAGGCAATACAGGGTC 49.2 CTTTACACGCATAACACG 47.4SSR011 (TC)18 FE536561 162 AACTTGGCAATGTTCGCTAT 55.2 GCTTGTTCTTGACAGGCTTC 54.9SSR012 (TC)8tatct(AC)8 FE536456 161 GGTCCATTCCTCTTATTTCC 52.9 GCCATCAAGTGGTCGTCT 55.6SSR013 (AGC)6 FE536096 162 CAGTCCAACAGCCCGACCAG 63.4 ATCATCATCGCCAGCATCCC 62.4,从NCBI数据 库 下 载 鼠 尾草 属 EST 序 列11747条，其中包 括 丹 参 EST序 列 10228 条和 Salvia fruticosa 1519 条，应用 Active Perl5.6.1.628对 含有SSR的 序 列进行搜索。搜索参数设置为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷 酸 和 六 核 苷酸 最 少 重 复 次数 分 别 为18次、6 次、5 次、4 次、4 次、3 次,11/22/2017,丹参的 EST-SSR 分布频率与特点,丹参 EST-SSR 中共包含 77 种重复基元。单核苷酸重复有 1 种 A/T。二核苷酸重复也为 3 种，以 AG/CT为主，占 64.21%。三核苷酸重复为 10 种,丹参 EST-SSR 信息情况表,单核苷酸重复 1 1069 53.08 10.45二核苷酸重复 3 380 18.87 3.72三核苷酸重复 10 450 22.34 4.40四核苷酸重复 6 15 0.74 0.15五核苷酸重复 9 13 0.65 0.13六核苷酸重复 48 87 4.32 0.85总计 77 2014 100.00 19.69,11/22/2017,丹参二、三核苷酸重复基元情况表,二核苷酸重复 AC/GT 60 15.79 0.59 AG/CT 244 64.21 2.39 AT/AT 76 20.00 0.74三核苷酸重复 AAC/GTT 8 1.78 0.08 AAG/CTT 79 17.56 0.77 AAT/ATT 9 2.00 0.02 ACC/GGT 14 3.11 0.03 ACG/CTG 123 27.33 1.20 ACT/ATG 41 9.11 0.40 AGC/CGT 36 8.00 0.35 AGG/CCT 25 5.56 0.24 AGT/ATC 95 21.11 0.93 CCG/CGG 20 4.44 0.20,11/22/2017,第三部分 不同产地丹参分子生药基因组的分析,11/22/2017,不同产地丹参遗传关系的DNA标记分析,利用RAPD与ISSR标记对不同产地的野生与栽培丹参的遗传变异进行分析,以期为丹参药材的引种栽培与科学选育提供科学依据。,不同产地丹参野生与栽培药材RAPD与ISSR标记的遗传变异,野生药材 S-SDYS 3 7 6. 86 0. 0314 山东沂水 S-SD 3 11 3. 57 0. 0078 山东 S-SDPY 2 12 11. 76 0. 0439 山东平邑 S-SX 2 17 16. 67 0. 0675 陕西 物种水平 10 62 60. 78 0. 1738 总计 50 97 95. 10 0. 2389,11/22/2017,结论：不同产地丹参的遗传分化根据POPGENE计算不同产地丹参间Nei无偏遗传距离与遗传一致性见表3。10个产地的丹参间,产自山西运城的丹参(S-SXYC)与来自江苏滨海的丹参(S-JSBH)的遗传距离最小,为0. 099 6;而来自山西运城的丹参(S-SXYC)与来自山东的丹参(S-SD)的遗传距离最大,为0. 377 7;遗传一致性正好与遗传距离相反,遗传距离最小的两个产地的丹参,遗传一致性表现的最大, S-SXYC与S-JSBH之间的遗传一致性最大,为0. 905 2,表明它们之间的亲缘关系最近。江苏3个产地居群的遗传一致性介于0. 826 7与0. 838 9之间,平均0. 833 9;山东3个产地的丹参遗传一致性介于0. 689 8与0. 808 8之间,平均0. 759 7,表明不同产地的丹参间存在明显的遗传分化。,11/22/2017,第四部分 高质量的丹参叶片DNA的提取方法研究,11/22/2017,材料和方法,样品的采集及预处2004年7月9月份在泰山采集白花丹参的成熟叶片,凉干保存1个月。试剂和仪器1试剂CTAB(上海生工),Vc(北京鼎国),SDS (上海生工), PVP (上海生工),-mercap-toethanol(上海生工),Taq酶(Takara),AFLP corereagent kit(invitrogen,Cat No 1084-016)。2仪器PTC-100基因扩增仪(MJ公司),Al-legra TM 64R centrifuge(BECKMAN)离心机,DNA离心真空干燥器(Savant),EC-600-90 (E-C appara-tus corporation)高压电泳仪,11/22/2017,方法,改良CTAB法:用常规CTAB法作为基本方法,添加一些抗氧化剂和提高CTAB的比例。处理A:提取液中加Vc干粉末30 mg (15mg/mg叶片)。处理B(PVP预洗法):加PVP粉末(干叶量的10%),与干叶共同在液氮下研碎。加入4预冷的CTAB-free buffer(02 M Tris-cl pH80, 005 MEDTA,025 M NaCl,内含4%-mercaptoethanol),冰上放置10 min,7000 rpm(不能太高,否则膜破,DNA损失),4,离心10 min,弃上清。然后加Vc干粉末(1 mg/mg干叶片)于4CTAB提取液中,调pH值为6065DNA琼脂糖电泳及浓度和纯度的测定用08%琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定OD260/OD280的方法判定DNA的质量。AFLP进一步分析DNA质量取250 ngDNA用EcoRI/Mse I消化,限制酶切片段经T4DNA连接酶与接头连接及PCR扩增,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色,以构建出重复性好、多态性丰富的基因组DNA AFLP指纹图谱来进一步评价DNA质量。具体方法参照试剂盒说明书进行。引物组合为(E-AAG: GAC TGC GTA CCAATT CAA G;