【毕业学位论文】（Word原稿）抗病小麦中与大麦黄矮病毒CP蛋白和RdRp复制酶相互作用蛋白的研究作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 抗病小麦中与 大麦黄矮病毒 互作用 蛋白 的研究 on on I 摘 要 黄矮病是由 大麦黄矮病毒 （ 引起的 小麦重要病毒 病 。 本研究组 已 将源于中间偃麦草的抗黄矮病基因整合到小麦基因组中，创建了一系列 抗黄矮病小麦 抑制 明确抗黄矮病小麦易位系中哪些蛋白与 研究利用酵母双杂交系统，从 P和复制酶 NA 互作用的蛋白 ，对其 进行 结构 预测和表达分析，取得以下结果 。 有酵母转录因子 的载体 建了 酵母双杂诱饵载体 转化酵母 细胞进行表达分析。结果表明， 达的融合蛋白对酵母 细胞 没有毒害作用，且自身没有激活性，可作为 酵母双杂系统 的诱饵载体 。 t 5 of NA 术 构建 抗黄矮病易位系 母双杂交 该文库 包含 80万个转化子 ， 均含有酵母转录因子 活域 ( 重组率达 88%, 插入片段大小为 滴 度为 3107 筛选 母双杂交 两次 筛库 ，分别 获得 155个和 144个候选 阳性 克 隆。 通过 两轮 高严谨度的 筛选， 从第二次筛库所得 候选 阳性 克隆中， 鉴定出一个能够在 克隆 插入片段编码 丝氨酸 /苏氨酸蛋白激 酶 (分序列 ， 将该基因命名 为 一步的 活性 定量分析和载体互换实验证实 ， 酵母 中 表达的 互作用是特异的。 采用 巢式 of 术， 从 60个氨基酸组成， 其 有 丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 的 保守结构域。在小麦中尚未 发现与之同源的蛋白。二级 结 构预测显示， 由 21个螺旋， 19个链 和29个拐角 组成 。 个 与 结构和 1个 质子受体 相关活性位 点。 利用 高级结构 。 上述结果表明， 氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 。 5 利用 实时定量 表达情况 进行分析，发现大麦黄矮病毒侵染抗病小麦易位系 够 提高 达 量 ， 与此相反， 大麦黄矮病毒 侵染 感 病小麦 后 则 抑制该基因的表达 ， 表明 矮病 反应中具有重要作 用。 统 ，以 选酵母双杂交 同一个克隆里分离出 2个 质粒 ， 分别命名为 350， 长素应答因子（ 蛋白 的部分序列， 个 未知蛋白。 共 同转化酵母能激活报告基因的表达 ,三者可能以 “防卫假说”模式发生相互作用。 关键词 ：小麦 ， 大麦黄矮病毒 ， 外壳蛋白， 相互作用蛋白 by is of of of in In to to NA of to be be of as 1. of NA of in D/ t D/D/no in be as in to P 2. A . of a 00,000 107 is 8%, .2 3. To P, to a P as a a P 4. By CR of a 60a TK in of no in 1 19 9 in 5. of CR it an in to a as a 500 350 500 an 350 500, a , NA , 录 第一章 引言 . 1 . 1 物抗病基因及病原物无毒基因 . 2 物抗病基因 . 2 原物无毒基因 . 5 病信号传导 . 8 物抗病毒基因工程 . 9 . 11 . 11 . 12 . 13 . 13 . 14 . 14 . 17 题意义和技术路线 . 19 题意义 . 19 . 20 第二章 酵母双杂交诱饵载体及文库的构建 . 21 . 21 . 21 果 . 22 论 . 24 母双杂交 . 27 料 . 27 法 . 27 果 . 32 论 . 34 第三章 利用 库 . 35 . 35 . 35 法 . 36 果 . 40 用 库 . 40 V 选阳性克隆检测及测序分析 . 44 . 46 . 46 论 . 48 第四章 因全长 列克隆及结构和表达分析 . 49 料和方法 . 49 料 . 49 法 . 49 果 . 54 . 54 . 54 构分析 . 54 . 60 论 . 61 第五章 大麦黄矮病毒复制酶与 . 64 料和方法 . 64 料 . 64 . 64 . 64 . 64 质粒共转酵母激活报告基因的表达 . 68 500与酵母 . 68 论 . 70 第六章 结论 . 71 参考文献 . 72 致谢 . 91 作者简历 . 92 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 物 抗病机制假说 蓝藻是地球上最早出现的绿色植物，其最早的化石距今已有 35亿年的历史（张昀 ， 1998）。 经过漫长 的 适者生存 进化 ，植物在物理结构和化学分子水平上 演化出精致的抵御病害侵染的机制。 植物固有形态结构的机械坚韧性、对病原物酶作用的稳定性 ，或者病原物侵染所引起的亚细胞、细胞和组织水平的形态结构改变，都能使 植物对病原物表现出相应的被动或主动抗 病 性。植物化学 抗病性 因素也可分为被动和主动的两种。 植物化学的被动抗病性因素 是指植物天然 含有 抗病原、抑制病原活性的物质，或 缺乏病原物寄生和致病所必需的重要成分等。 主动抗病性的化学因素主要有过敏性坏死反应、植物保卫素形成和植物对毒素的降解作用等 。 植物因化学因素而对病原物表现出主动抗性一直是植物病理学和植物抗病育种研究的重点问题。 植物如何识别病原物？植物和病原物体内的哪些成分参与了植物和病原物之间的相互作用？ 植 物对病原物的主动抗性是如何被诱发的？为了回答这些问题，人们提出很多关于 植物抗病分子机制 的 假说。 这些假说中较为著名的就是基因对基因假说。 早在 20世纪 40年代， 亚麻锈病(作体系中遗传关系的研究（ 1942）， 并根据研 究结果提出基因对基因假说 ( 1956； 1971） 。 其基本内容是 : 病原与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型 , 亲和与不亲和病原分别含毒性基因 (和无毒基因(, 亲和与不亲和寄主分别含感病基因 ( r) 和抗病基因 (R) ； 只有 当携 因的病原与携 二者 才 表现不亲和 , 即寄主表现抗病 。而其它三种组合 , 二者表现亲和 , 即寄主表现感病 （ 张德水 和 陈受宜 ， 1997） 。 配体 是基因对基因假说在分子水平上的解释 （ 1990； 1995）。 基因对基因假说的分子基础就是配体（ 受体 (结合， 植物 抗病基因的产物作为受体对病原物 无毒 直接或间接产生的配体或激发子进行识别， 产 生信号，通过传导途径传播， 进而激活下游的防御反应。一些关于植物蛋白与作为配体的病毒、细菌、真菌无毒基因（ 码的蛋白间的相互作用的研究，从分子水平上证明了 番茄 抗性 （ ， 1996）。 在水稻 抗性 （ ， 2000） 。在 南芥的 ， 1997） 。但是 仅靠植物受体蛋白与作为配体的病原物无毒基因的互作，不能介导植物对病原物的抗性，还必须有其它蛋白的参与， 才能激活植物防御反应系统，最终使植物获得抗性。 在番茄 已知有 （ 1996； 995； ， 1997） 。 有人 提出了一个 直接分泌进人寄主细胞 (可能通过 分泌系统 )，与寄主细胞内蛋白激酶 互作用， 激活 ，引起 信号 磷酸化级联放大 ；经 径 最终导致寄主细胞表现 过敏性反应（ ，而 ，结合于 活 寄主表现抗病性 （ 杨民和郑中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 重 ， 2001） 。 但是支持基因对基因假说的实验数据不是很多 （ ， 2006; 003） ，于是人们又提出 防卫假说 ( ， 2001； ；1998） 。 防卫假说 认为 ：病原物蛋白的毒性是相对的，对 不 含抗病基因的植株表现 有 毒的蛋白在含 抗病基因的植株中可能表现为 无 毒蛋白； 病原物的有毒因子不直接与抗病基因产物发生相互作用，而是与卫兵蛋白 (生直接互作；卫兵蛋白与病原物有毒因子互作后，形态发生改变，抗病基因能够检测到这种改变，并激发植物防御反应系统，使植物表现出抗病性 （ 2003； 2004） 。 支持防卫假说的最好的例子就是卫兵蛋白 2002） 。 抗病基因 够检测到 激活植物的防御体系（ 2002； 2003） 。 在植物体内， 物中 以 合体的形式存在 ， 病原 物 复合体作用使 致一系列的信号传递， 最终发生防卫反应 (2003；王友红 等， 2005)。 物抗病基因及病原物无毒基因 物抗病基因 植物抗病基因指植物体内存在这么一类基因，其编码的蛋白能够与病原物无毒基因产物相互作用，或者能够识别相应的卫兵蛋白与病原物无毒基因产物的相互作用，从而进一步激活植物的防御系统，使植物对病原物表现出抗性。 到 2004年为止，已克隆的植物抗病基因有 50多个，根据它们保守的结构域特征可以将其 分成九种类型 ： S/K、 从表 酸结合位点（ 和 富含亮氨酸重复序列（ 保守蛋白序列。 个 结构域： 1994)。 这 3个结构域可以通过结合核酸、水解 核酸来调控蛋白的功能及控制细胞调亡（ 2003） 。 除了这 3个常见的结构域， 2006） 。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 3 1991; 1994. , 1995 1996 , 1998 1998 1998 1998 , 1999 , 2001 P , 2000 , 2000 f. 2001 P 2000 P , 2002 f. , 2001 N 1994 1995 M M 1995 , 1997 2002 1998 1996 , 1998 1999 2002 2002 1997 f. 1997 , 1998 , 1998 表 克隆的植物抗病基因 国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 4 , 1999 1999 1999 2000 2001 P 2002 1994 1996 1997 1997 1998 1999 1992 S/ 1993 K 1995 f. 1997 . 2002 . 2002 . 2003 . 2003 . ea 2004 2000 2000 注 :S/位于植物 端，其通常被认为能够与病原物的无毒基因相互作用 。酵母双杂交实验表明 抗稻瘟病基因 2000)。 定植物抗病基因的抗病特异性 （ 2001） 。 通过对亚麻 因间结构和序列的差异在 示着 1999)。 此外，对 12进行的突变实验，进一步说明这种相互作用的特异性。 从表 大部分已经克隆的抗病基因含有 这 5类抗病基因除包含 附加 亮氨酸拉链 ( 似区域、 跨膜功能域 (和 丝氨酸 /苏氨酸激酶（ 守域 。 不包含 包含 。1993)应用定位克隆法分离出番茄抗霜霉病基因 其编码蛋白 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 5 苏氨酸激酶。 04位苏氨酸决定着 ， 1998） 。 1997） 克隆了大麦的 变能够 引起 大麦对绝大多数白粉病菌生理小种的高效持久的广谱抗病性。 大麦抗白粉病 基因 预测其为跨膜蛋白。 此 细胞死亡 表现出 负调控作用， 另一种解释是， 产生的后果 （ 1997） 。 此外 ， 玉米 一个克隆的 该基因负责 合成 一个环状的四肽 使玉米 对 圆斑病菌 (1号小种产生 抗性 。 个 烟草蚀纹病 (病基因，它们编码的蛋白具有 木菠萝素凝集素结构域（ 。 这类 具有 木菠萝 素凝集素结构域 的 蛋白可能在禾本科植物的防御和抗逆反应中发挥重要作用。 椒 ()中分离出的抗 马铃薯 , 病基因，其编码的蛋白属于 翻译起始因子 4(， 而 茄花叶病毒 (的 原物无毒基因 在“基因对基因”假说中，病原物的无毒基因 (指 其编码的蛋白能够 与寄主抗病基因 产物相互作用， 并因为这种 病原物与寄主互作的 不亲和性，而使寄主植物表现抗病性 的基因 （ ,1990）。 病原物中与无毒基因相对的是毒性基因 (而植物中与抗病基因 (R)相对的是感病基因 ( r)。在病原物 与寄主的关系分析 中，只有当携 基因的寄主互作时 , 二者才表现不亲和 , 即寄主表现抗病。而其它三种组合 , 二者表现亲和 , 即寄主表现感病。在防卫假说 中，病原物蛋白的毒性是相对的，对不含抗病基 因的植株表现有毒的蛋白在含抗病基因的植株中可能 表现为无毒蛋白。防卫假说 的无毒病原物的有毒因子直接与卫兵蛋白 (生直接互作 ，形态发生改变。抗病因子 能够检测到这种改变，并激发植物防御反应系统，使植物表现出抗病性 。不管是基因对基因假说，还是防卫 假说，病原物无毒基因对于植物抗病性的诱发是必要的。因此病原物无毒基因是抗病机制研究的一个重要内容。 菌的无