【毕业学位论文】（Word原稿）辣椒抗病相关CaWRKY转录因子基因的分离及特性研究分子植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 辣椒抗病相关 录因子基因的分离及特性 研究 in of in 摘 要 植物在应对外界生物与非生物胁迫过程中获得了一系列复杂的植物防卫反应机制。这种由于自身进化而获得的防卫机制，主要是通过植物防卫反应基因的转录激活与转录抑制发生作用的。植物识别病原物后 ，通过一系列信号传递过程，最终诱导相关植物防卫反应基因的表达。在此过程中，转录因子起着重要的作用，它通过与其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制防卫基因的转录，同时，一些转录因子其自身也是受诱导调控的，改变特定的转录因子的表达条件会使植物的胁迫抗性发生很大变化。 因此，转录因子在植物防卫反应基因的表达调控中起关键作用。特别是 单个植物防御反应基因的超表达可增强植物对特定病原物的抵抗能力，而一个转录因子基因的超表达能够激活多个下游抗病基因的表达。因此，利用防御反应相关转录因子基因来改良植物的综合抗病性，是一条很有潜 力的分子育种途径。 白是一种只存在于植物体的新的转录因子 超 家族 ，其成员广泛参与了植物的生长发育、代谢以及对生物或非生物胁迫的反应，尤其是在植物抵御病原物侵害 的 抗病反应中具有重要的调控作用。 本研究以 高抗辣椒品种 为材料，利用 同源克隆法在经水杨酸诱导处理的辣椒叶片中分离到 6条 因 片段 ， 命名为 ， 其中 5 条为辣椒 扩增得到的 6 条 段 中 段 长度为 659有两个 构域 ,其它 5 条 片段 都在 150右，只检测到一个 构 域。通过对这 6 条 因进行同源与进化分析，发现其中 条基因的亲缘关系较近，而 其它基因同源性较低。通过将 6 条 因 的蛋白翻译序列 与抗病相关拟南芥第三家族 员及茄科植物中已分离的 白 进行进化分析，发现这 6 个 基酸序列 与拟南芥第三家族的亲缘性较低，而与茄科植物的 白亲缘关系接近。其中 报道的抗病相关的烟草录因子如 缘关系非常接近，因此推断 、 4、 6 可能在植物抗病防卫反应中有相关作用。 通过同源进化分析，并由于已获得的长 片段 的易操作性，无论是 增中引物的设计还是杂交探针的制备都能提供更多的序列信息，因此本实验最终确立 后续实验的靶标基因。对此基因进行 终获得部分 3列 ，长 1265码 290 个氨基酸 。对列翻译后进行分析 ，该 因的氨基酸序列分别在 N 端和 C 端各具一个 构域 和 一个 锌指结构，因此可推断该基因属于 一家族成员。 为进一步探索该基因在不同诱导剂诱导下的表达情况，以便揭示该基因可能参与的防卫信号途径。本实验采用半定量 方法及 证对 因的表达模式进 行了初步的探索。结果表明， 水杨酸及 导下表达量有明显增高趋势，在 导下基本不表达。说明 因可能参与 号途径。 由于前期实验中已证实 因受 导表达，说明该基因可能参与相关的诱导抗性反应，因此，为进一步验证 生物胁迫下的表达情况，从而揭示出其相应 的功能活性，本实验对辣椒进行了疫霉及线虫侵染实验， 以 探究 辣椒防卫反应中的作用。经 交 验证表明， 辣椒疫霉侵染过程中， 达无明显变化，而接种二龄根结线虫后，其表达量有明显增强现象，故推 测 抗疫病 反应 中可能无 特异应答 作用，而在抗线虫反应中 可能重要 的 作用。 综合上述研究结果， 辣椒防卫反应基因簇的表达调控中 可能 具 有重要的作用。辣椒是一种重要的蔬菜作物，辣椒疫病、根结线虫等生物灾害是影响我国辣椒生产的主要障碍，因此， 尝试 利用 因 在辣椒中的超表达来提高 其 综合抗病性，将是一 种 颇具潜力的分子育种途径， 这 对于揭示辣椒抗病作用分子机理也具有重要的作用。 关键词 : 辣椒 ， 转录因子，基因克隆，诱导调控 to of to is or of of A in is of a of to to a of In a to or of of to of a of R a of of in of It is a to a of to to be in of in in or of is is CR of of in ,3,4,6 of is ,4,6 ,4. ,4 in of in we ,4,6 ,4 in we We of It 265a 90 a at we . To we A, A on it t A We is at a by in a an in to In an in of in is an in of of on it is a to by to of in is 目 录 英文缩略表 . I 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 录因子的主要结构特征及其功能特性 . 1 构域 . 1 盒 . 2 白与 W 盒的结合特性 . 3 因的表达活性 . 3 白的生物学功能 . 4 录因子调控的靶标基因 . 4 白在防卫反应信号转导途径中的作用 . 5 白在植物形态发育上的作用 . 5 束语 . 6 第二章 实验设计 . 7 题意义 . 7 术路线 . 7 第三章 材料与方法 . 9 试材料 . 9 验材料 . 9 要生化试剂 . 9 验设计与方法 . 9 A 诱导处理 . 9 椒疫霉接种实验 . 10 虫接种实验 . 11 取 . 11 合成 . 12 片段 的回收、克隆与测序 . 13 得全长 . 17 物信息学分析 . 19 定量 证 . 19 交 . 21 第四章 结果与分析 . 25 基因 片段 的获得与生物信息学分析 . 25 提取 . 25 合成及内参检测结果 . 25 源克隆法获得辣椒 基因 . 26 序结果与生物信息学分析 . 27 验克隆基因全长 . 31 增实验 . 31 末端 列分析 . 31 列拼接 . 31 因在不同诱导剂诱导下表达情况分析 . 33 因在生物胁迫下表达情况分析 . 35 椒疫霉接种实验中 因表达情况分析 . 35 虫接种实验中 因表达情况分析 . 36 第五章 讨论 . 37 源克隆技术扩增 因及进化分析 . 37 列 导抗病性 . 37 植物生物胁迫应激反应中的作用 . 38 第六章 结论 . 39 参考文献 . 40 附录 . 45 致 谢 . 47 作 者 简 历 . 48 中国农业科学院 硕 士学位论文 英文缩略表 I 英文缩略表 英文缩写 中文名称 英文全称 杨酸 莉酮酸甲酯 转录聚合酶链式反应 因特异引物 光密度值 R 病程相关 端快速扩增基因全长法 of 分钟转数 统获得抗性 c 辣椒疫霉 南芥 t 烟草 铃薯 a 辣椒 P 上游引物 P 下游引物 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 导言 植物在应对外界生物与非生物胁迫过程 中获得了一系列复杂的植物防卫反应机制 (2001)，现有的研究表明，这种由于自身进化而获得的防卫机制，主要是通过植物防卫反应基因的转录激活与转录抑制发生作用的 (1998)。植物识别病原物后，通过一系列信号传递过程，最终诱导相关植物防卫反应基因的表达。在此过程中，转录因子起着重要的作用，它通过与其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制防卫基因的转录，同时，一些转录因子其自身也是受诱导调控的，改变特定的转录因子的表达条件会使植物的胁迫抗性发生很大变化 (et 2002)。例如， （ 2002）在辣椒中过表达 因而使辣椒抵抗外界病原物的能力明显增强。在拟南芥中，全基因组中 5的基因用于编码大约 1500 种转录因子，其中 45%的转录因子只存在于植物中，说明植物具有较动物及微生物不同的自身特殊的防卫反应体系 (et 2000)。因此，利用植物特有的转录因子来改良植物的综合抗病性，是一种高效、快捷而颇具潜力的分子育种途径，这对于揭示植物抗病机理也具有重要的作用。 目前研究表明，与植物防卫反应有关的转录因 子家族主要有： 白、碱性亮氨酸拉链蛋白（ et 2002)，其中 1994）首次从甘薯 (克隆出一个编码 (T)(T)序列 (后被称为 结合蛋白的 (1994)，随后在不同植物中克隆出大 量编码 W 盒结合蛋白的 野生燕麦(的 (et 1995) ， 皱 叶 欧 芹 （ 的,3(et 1996)，拟南芥的 et 1996)，等等。迄今为止，已报道从拟南芥、烟草、大麦、小麦、野生马铃薯、水稻，棉花、可可豆、甘菊、甘蔗、沙漠豆类中均分离出 因 (et 2000; et 2003; 2004; et 2004; Xu et 2004; et 2004; et 2002; et 2001; et 2002) ，其中水稻全基因组中已鉴定出大约 90 个 因 (et 2004)，拟南芥中 已分离出 74 个因 (et 2000)。对 白进行序列分析，发现它们都具有 一或两个含一个列和一个锌指结构的约 60 个氨基酸的区域。特定的 录因子在病原物、化学物质及外界损伤的诱导条件下，会促进其表达活性及增强与 合的能力。尽管 合域，但其整体的蛋白结构却表现出高度的差异性，从而分化出不同的家族，在特定的时间和空间行使不同的功能活性。 录因子的主要结构特征及其功能特性 构域 构域是由自身 N 末端具有的高度保守的 基酸序列和一个锌指结构而中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 命名。已鉴定的 白都能专性的结 合 (T)(T)序列，而这种结合特定 列的功能是由 白中的 构域行使的 (et 1999)。已被鉴定的 白的氨基酸序列中都含有一或两个 构域。依照它们所含 构域的个数及锌指结构的特征将 白分为三类：含有两个 构域的 白为类，如最早被鉴定的 ；含有一个 构域的 白为类，如 ，已被鉴定的大多数 白都属于第 类，只含有一个 构域；与其他已鉴定的锌指结构比较，第、类 构域具有特殊的锌指结构类型，即 构(CC3H)， 而另一些 白的锌指结构与第、类不同，其锌指结构为 构 (C)， 因此将之归为第类，如烟草中分离出的 录因子中的锌指结构就为 构 (2000)。值得一提的是，尽管在高等植物中，第类 白占其家族成员的 20，但在一些低等 植物如苔藓类植物中却不存在 (2004)。而在拟南芥中，几乎所有的第类 白都与应答生物胁迫反应有关 (et 2003; et 2003)，表明该类 因在陆生植物基因进化史上处于较后的位置，这可能是植物由于环境压力而发生的适应性进化。不同的是，第类 白不仅存在于高等植物，也存在于蕨类植物，而且在一些不能进行光合作用的真核细胞中如粘液菌和单细胞原生生物中也被检测到 (2004)，这些资料揭示出 白可能起源于十五到二十亿年前未分化出植物界之前的真核细胞，且第类 白则是最初的蛋白表现形式。 在类 白中，它的两个 构域具有不同的功能活性。在甜薯 芹拟南芥 录因子中，结合 W 盒的都是位于 C 末端的 构域。 N 末端的 构域的功能尚不清楚，由于 C 末端 构域以外的区域对于整个 白在结合特定 列过程中起到一个整体协调的作用，因此，推测 N 端的 构域在参与合的过程中，可能会增 强转录因子与目标序列结合的亲和性与识别特异性。也有认为它可能如同锌指结构域的功能一样会为蛋白与蛋白相互作用之间提供接触面，通过与其它蛋白之间的相互作用而进一步提高转录因子与 合的效率 (et 1999)。在只含有一个 类 白，其 构域的功能与第一家族中的 C 末端的 构域更为相似，表明单个 构域与 C 末端的 构域在功能上是等价的，是行使结合 能的主要成分。 白家族成员的另一个共同点是 构域对应的编 码序列中都有 1 个内含子，且其位置高度保守 (et 2000)，存在的意义不详，可能预示着这类转录因子存在转录后加工的调节。 W 盒 构域的保守性从顺式作用元件 W 盒的保守性中得到了很好的反映。这些(T)(T)序列元件包含一个 变中心 ,它对于 录因子的结合是必不可少的。 W 盒在很多与植物防卫反应有关的抗病基因启动子中都存在，例如，在已被广泛研究的 叶欧芹中 因、烟草中 因，拟南芥中 因的启动子中都含中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 有不 同形式的 W 盒 (et 1996; et 1999; Yu et 2001)， 录因子通过与抗病基因启动子中的 W 盒结合，激活下游基因的表达，从而开启植物的防卫体系。通常具有功能活性的 W 盒会在启动子的伸长区内成簇或分散存在，以镜像或顺式排列 (2001)，这种存在方式对 录因子与 W 盒的结合功能有增效作用。而且，一些 录因子自身的启动子中也存在 W 盒，例如，在皱叶欧芹中发现的 因的启动子中就含有 3 个 置靠近，其中 回文排列，三个 W 盒具有协同作用，而不是简单的叠加 (et 1999)。为了更确切地研究 W 盒在基因表达调控方面的作用， (2002)用人工合成的启动子，其中只含 W 盒而排除其它可能的转录因子结合元件，研究对病原体及其诱发因子或创伤反应的结果表明， W 盒足以介导防卫和胁迫反应，且反应程度与 W 盒的数量及位置有关。 白与 W 盒的结合特性 之间的相互结合作用在体内或体外实验已得到多次证明。例如， (2003)利用凝胶电泳 迁移 (验 ， 检测从拟南芥中分离的 白与 W 盒的结合作用，结果表明， 如果 白与之结合的能力会迅速下降或完全消失，因此说明这种结合作用是高度特异的 。尽管 白总是倾向于结合 W 盒序列，但不同的 白对于其特定结合的 W 盒元件的类型及其组成具有一定差异与偏好性。依照 列方式、间距以及侧翼序列的不同，各种 盒与之结合，行使特有的功能活性 (et 1999, 2000)。 白与 有可能的金属离子是 这与 白中含有锌指结构是一致的，用金属络合剂如 1,10et 2001; et 2000)。另外， 为用碱性磷酸酶预处理强烈抑制这种结合，如 1999)用碱性磷酸酶处理 与 当加入磷酸酶抑制剂后，这种结合作用又会有所恢复。 此外，一些 白还具有亮氨酸拉链结构，此结构会使蛋白二聚化，促进 白与其它蛋白之间的结合，这种功能特性已在 的实验中得到证明，当删除 蛋白中的亮氨酸拉链结构，这些在酵母中进行表达的 白，与其相连的报告基因的表达量将会大大降低 (et 2000)。 因的表达活性 因在植物体内并非组成型表达，它会受外界环境的激发而诱导表达。大量的研究表明， et 1999; et 1999; et 2002; 2000;et 2004)、防卫反应信号分子如水杨酸及其功能类似物 (et 1999;Yu et 2001;2000)、环境胁迫如干旱 (et 2002)、低温 (2002)、创伤 (et 2000;et 2004)等不同的环境条件下都能被诱 导表达。 因表达的动力学特点是快速、瞬时，具有组织特异性，在许多情况下不依赖于其它蛋白从无到有的合成。例如皱叶欧芹受真菌诱导物的诱导， 15与未受诱导的空白对照相比，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 细胞中的 录本已有积累， 4590间达到最大值，而后迅速下降 (et 2002)。而烟草叶片机械创伤 (切口 )10，与不作机械创伤的相比，受伤的及上层未受伤的叶片中都有 录本 (累， 30达到最大值，然后开始下降 (et 2000)。同时 ， 2001)利用抑制性扣除杂交的方法在叶片衰亡期对调控基因进行了差异表达分析，其中在植株生长六周期的叶片中 录本增长很快，到七周期其表达量基本恒定，而到八周期该 量就呈急剧下降趋势。此外， 因的表达还具有组织特异性，已发现在植