【毕业学位论文】（Word原稿）无致病力hrp-突变体防治番茄青枯病作用研究植 物 病 理 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 无致病力 番茄青枯病 作用 研究 I 国农业科学院硕士学位论文 摘要 要 由 起的青枯病是发生于热带、亚热带及温带的一种毁灭性土传病害。青枯病菌的寄主范围很广，可以危害 35 个科的 200 多种植物，我国绝大部分省区都有该病的发生和危 害。随着新寄主的 不断 出现和近年来全球变暖等因素，世界范围内青枯病的发生也越来越普遍和严重 ， 探究青枯病致病和植物抗病机理以及寻找防治青枯病的有效方法显得尤为重要。 生物防治的研究和应用是当前青枯病防治的研究热点之一。过去沿用的生物防治措施的原理是通过拮抗微生物分泌的抗生素或水解酶来杀死病原物，或通过营养竞争影响病原物的繁殖和生长。近年来，国内外学者在利用基因工程手段获得的青枯病菌无致病力菌株防治植物青枯病方面取得了初步进展。研究发现，利用青枯病菌 因簇中的某些片断缺失的方法产生的无致病力突变体，在室内防治番茄青枯病取得了很好的效果，但 相关的机理还不清楚。本研究以 建立以我国番茄品种为材料的青枯病生防体系， 测定 其生防效果 ，并对 机理进行了 初步 研究。 首先分别采用 传统蘸根接种法和改良蘸根接种法，对供试番茄品种 接种青枯病致病菌株现感抗程度不同的 番茄品种对 株的反应在 两种接种方法中表现一致 ，但由于改良蘸根接种法存在着节省人力、物力和试验空间以及缩短接种周期等特点，成为本论文采用的接种方法，同时也为大量番茄青枯病苗期抗病性鉴定提供了一种迅速而有效的接种方法。 以中蔬 6 号为供试番茄品种， 预接种 现预接种 有良好的生防效果 ，而 72h 和 7d 的生防效果虽然大大降低，但仍有一定的生防作用。 预接种 接致病菌番茄植株，接种后第 2 天体内就出现了细菌，而且在番茄植株内繁殖很快，第 8 天达到最高值，细菌浓度为 1015g；而预接种 种后第 8 天才出现致病菌，第 10 天的细菌浓度为 106 g。 对接种的番茄进行茎基部组织超显微观察，接种 病菌 24h 及番茄发病中早期，番茄木质部导管内都发现了大量细菌，导管邻近薄壁细胞细胞壁发生降解；而同时期接种 胞壁正常。本研究中没有观察到由 侵填体等。可能由于所取植株部位不适所致，也可能由于植物细胞结构抗性不是 工作需要进一步验证。 用 番茄总 行表达分析，发现 能引起病程相关蛋白 表达，但在表达时间和表达量上存在差异。但该结果连同其他 白编码基因及其他防卫基因的表达还需要采用 交等方法进一步确认 。 关键词 番茄 ， 青枯病菌 ， 青枯病 ， 生物防治中国农业科学院硕士学位论文 is a in of a of 00 0 in of in is It is to of to to to an to be as of or or to of In on by It . by NA of on on in in is of is to up to of as to of by It of is in of of in In it a in o.6 it it of 2h d in . To of in in of 015g In on of of 8 on 106 g in 0th 中国农业科学院硕士学位论文 V No of as or in to of to be in of NA by in as as in of of R to be 国农业科学院硕士学位论文 目录 V 目 录 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 . 1 枯病菌的研究概况 . 1 枯病菌及其生理分化 . 1 枯病菌的侵染及传播途径 . 2 枯病菌致病菌株 基因组结构 . 2 枯病菌的致病因子 . 3 物青枯病的防治 . 6 业防治 . 6 学防治 . 6 病品种 . 6 物防治 . 6 茄青枯病的生物防治 . 7 物制剂 . 7 物因子 . 7 他生防因子的应用 . 9 茄青枯病生防机理 . 9 菌素的产生 . 9 殖位点竞争 . 9 导抗病性 . 9 第二章 实验设计 . 11 题意义 . 11 究内容 . 12 立有效的 茄致病菌的生防体系 . 12 防效果的测定 . 12 防机理初步分析 . 12 解决的关键问题 . 12 究的技术路线 . 12 第三章 果 . 14 茄感病品种和接种方法的确立 . 14 料与方法 . 14 果与分析 . 15 致病力 . 17 料与方法 . 17 果与分析 . 17 菌在番茄体内的繁殖曲线 . 20 料与方法 . 20 果与分析 . 20 第四章 无致病力 . 22 中国农业科学院硕士学位论文 目录 茄茎部组织的超微结构观察 . 22 料与方法 . 22 果与分析 . 23 4.2 . 25 料 . 25 果与分析 . 28 第五章 结论与讨论 . 31 参考文献 . 33 致 谢 . 39 作者简介 . 40 中国农业科学院 硕 士学位论文 缩略词表 略 词 表 英文缩写 英文名称 中文名称 炭酸二乙酯 病情指数 EG 切葡聚糖酶 外多糖 ET 烯 守区 敏性反应和致病基因 统诱导抗病 莉酸 -(-(合酶链式反应 PG 聚半乳糖醛酸酶 PR 程相关蛋白 枯菌 枯菌 福平 转录聚合酶链式反应 杨酸 统获得性抗病 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 1 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 由青枯病菌（ 起的 青枯病是一种全球分布的毁灭性土传病害。青枯病菌的寄主范围很广，可以危害 35 个科的 200 多种植物。我国绝大部分省区都有该病的发生和危害，长江流域以南发生尤其严重，一般田块发病率为 25 严重者达 80%甚至全田枯死，给番茄生产造成重大的经济损失，已成为番茄生产上的重要障碍（ 任欣正 等， 1994）。随着研 究的深入、新寄主的出现以及近年来全球变暖等因素，世界范围内青枯病的发生也越来越普遍和严重，因此，探究青枯病发病和植物抗病机理以及寻找防治青枯病的有效方法显得尤其重要。 研究表明，番茄对青枯病的抗性是由多基因或寡基因控制的，而且还存在一些受环境因素影响的微效基因（ 1964; 1986; et 1985）。由于番茄对青枯病菌抗性的复杂性，加之该病菌致病性的多变性，使得培育和推广应用抗（耐）青枯病品种受到限制；使用化学 农药进行防治，不仅不经济而且严重污染环境，并导致病原菌产生抗药性 。因此，包括生物防治在内的其它措施的研究和应用便成为当前青枯病防治的研究热点之一。 尽管国内外已在利用生物因子防治青枯病方面开展了大量工作，并获得了令人欣喜的防治效果，但对其防病机制的研究还很有限。基于以上研究背景，本论文研究了利用青枯病菌的无致病力 对 生防机理 进行初步分析 ，从而为青枯病的生物防治提供理论基础。 枯病菌的研究概况 枯病菌及其生理分化 青枯病病菌最早由 E F 定，并定名为 (1995) 根据病原菌的表型特征、脂肪酸图谱、 源性、 16列分析等多元分类研究后，建议更名为 分类变化已被国际细菌学杂志 （ 认可 （ 王金生， 2000；姬广海等， 1999；卢同， 1998） 。 R. 分为许多个复杂的菌系， 目前已形成两个国际公认的亚分类系统。一是 根据寄主范围将其划分为 5 个生理小种（ et 1962），我国番茄青枯菌主要为小种 l。二是根据不同菌株对 3 种双糖和 3 种己醇氧化产酸能力的差异，将青枯菌划分为 6 个生化型（ 1991），番茄青枯菌属生化型 3 和 4。生理小种与生化型之间无绝对关系，但小种 3 只含生化型 2（徐世典， 1991）。随着生物技术的发展，利用 析技术把 R. 分为两个主要的亚类，亚类 包括小种 1 和生化型3、 4、 5 的所有成员。亚类 包括小种 1、 2 和 3 和生化型 。与 料关系最密切的特征是菌株的地理 来源，亚类 菌株主要来源于亚洲和澳洲；亚类 除生化 型 2（小种 3）的马铃薯菌株外，主要来源于美国 （ et 1989） 。近年来，从欧洲起源的第三大类已经被鉴定 （ et 2000） 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 2 枯病菌的侵染及传播途径 R. 一种土传病原菌，受土壤中多种因子的影响。土壤温度低、湿度大、 干燥、淹水及过酸或过碱的土壤则影响其生存（徐世典， 1991）。该病菌通过植物伤口或直接侵入，在根部皮层迅速定殖，并进入植物导管系统 ，从而引起植物萎蔫并枯死(et 1995)。青枯菌可在土壤中和非寄主植物上存活或生存，通常引起植物系统发病，使植株矮化、萎蔫和死亡，属维管束病害，但也能引起植物组织（如叶片、茎髓部等）局部坏死。 病菌的传播途径多种多样，可通过土壤、流水、根与根接触、农事操作 （ 如整枝 ） 及繁殖材料调运等方式传播（王金生， 2000； et 1993）。 枯病菌致病菌株 基因组结构 2002 年，致病菌 株的整个基因组被测序。 序列具有马赛克（ 构，包含了大量具有潜在进化信息的元件。一系列推断参与致病的基因已经被鉴定出来。包括编码参与植物细胞壁降解的水解酶的基因和一些为植物激素（生长素和乙烯）的产生或植物信号分子（乙烯和水杨酸）的降解所需的基因。如表 1 表 1 青枯病菌 in 致 病 性 基 因 基 因 编 号 已知基因 型 分 泌 系 统 与 分 泌 作 用 因 子 31 全 局 调 节 功 能 因子 11 胞 外 多 糖 生 物 合 成 因 子 18 水 解 酶 4 激 素 产 物 1 候选基因 依赖 型 分 泌 系 统 作 用 因 子 1 以 同 源 为 基 础 的 型 作 用 因 子 25 以 结 构 特 征 为 基 础 的 型 作 用 因 子 26 附属 /表 面 蛋 白 93 血 细 胞 凝 集 素 相 关 蛋 白 27 纤 毛 生 物 合 成 蛋 白 35 其它菌 毛 /纤毛 24 水 解 酶 /寄 主 细 胞 壁 降 解 酶 5 毒素 1 抗 氧 胁 迫 因 子 10 植 物 激 素 和 信 号 分 子 7 其它 16 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 3 枯病菌的致病因子 R. 顺利地完成从土壤到植物地上部分的侵染历程，需要有许多专门基因产物的作用。如在营养获得、通过细胞间隙的移动、木质部导管的穿透和逃避植物免疫系统的过程中起作用的蛋白。需要确认这些专门的因子在时间、地点、以及产生的数量，了解这些由调节网络控制的基因产物的生化特性以及其可能的生理功 能，对如何防治青枯病是很重要的 （ 2000） 。 对 R. 病因子的研究，国内外已有许多报道。主要涉及到胞外多糖（ 果糖酶（主要是多聚半乳糖醛酸酶， 纤维素酶（主要是内切葡聚糖酶， 鞭毛运动性以及 因簇等。 外产物 胞外多糖 R. 胞外多糖（ 高度复杂的多糖混合物组成。研究发现， 失突变体菌株不具备完整的致病能力，很少在感染的植株茎内定殖，说明 够减小或避免植物抗病系统对细菌表面结构的识别（ et 1998; et 1997）。 阻塞导管，影响和阻碍植物体内水分运输，从而引起植株萎焉（何礼远，康耀卫，1995）。然而也有人对 致病重要性持相反观点。众多研究表明， 定殖中很重要，但不是必要条件。 内切葡聚糖酶 内切葡聚糖酶 （ 可能参与植物胞壁葡聚糖的降解，从而直接影响青枯菌侵入植物组织，有利于胞壁被其它酶（如多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶）降解，释放植物细胞组分而供青枯菌营养。 失突变体能导致其致病性的降低，主要表现为推迟发病，而后来仍然能引起番茄死亡，说明 于青枯菌的致病性并非绝对必需，但它能影响病害发展的速度（王金生， 2000）。 多聚半乳糖醛酸酶 多聚半乳糖醛酸酶（ 水解酶类，分为内切多聚半乳糖醛酸酶（ 外切多聚半乳糖醛酸酶（ 种。 R. 金生， 2000）。 2000），但它在致病中的真正作用有待于进一步研究。 毛运动性 以前的观点认为，青枯菌野生型菌株均不运动，而自发无毒突变株大部分具有明显的运动性（毛国璋等， 2000；白小军等， 2000）。但研究结果表明，由鞭毛介导的细菌运动性对细菌在侵中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 4 染并定殖于寄主植物的早期起了重要作用。 鞭毛运动怎样在 R. 病早期起作用呢？ R. 后再通过皮层进入原生木质部。在这个致病过程中，细菌运动是必不可缺的。细菌运动能帮助病菌从被侵染的木质导管移至附近未被侵染的导管和木质部软组织细胞中。鞭毛（ 性伞毛（ 毛附属物的一种形态），位于细菌的尾部，可帮助细菌粘附寄主细胞（ 1997）。最后，鞭毛运动经常形成生物膜（ O998）。这些特殊的集合体，似乎可以保护 细菌免受寄主的抗性，还可能有助于细菌的潜伏侵染和营腐生生活（ et 2001）。 细菌运动能力与调节系统流（ 许多已知的致病因子有关，由一种细胞浓度反应敏感的调节因子 培养基中，细菌群体达到 107et 然后， 内切葡聚糖酶（ 表达，其它蛋白可能由复合调节流中的其它因子调控表达 （ et 2000） 。在诱导其它致病因子的同时， 控制降解植物胞壁的多聚半乳糖醛酸酶和调节细菌运动的正调控因子 的转录抑制其它因子的表达 （ et 1997） 。推测细菌在腐生生活和植物萎蔫发生早期，当细菌细胞浓度很低并且 R. 胞是运动的；当细菌群体在寄主木质部内增殖时， 在感染晚期诱导 过抑制 996） 。 因簇 青枯病菌 因（ 决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植物过敏性反应的基因。 R. 因簇为基因马赛克（ 构，包括调节编码基因、 守区 （ 基因和编码分泌蛋白的基因 ， 如图1因编码 型分泌蛋白（ 核心部分。 许多动植物细菌侵染过程中扮演中心角色，这一系统可 能横跨内膜和外膜，直接将各种各样的致病因子及非致病性蛋白输送到植物细胞的细胞质中，促进细菌从植物吸收和 /或抑制寄主的免疫反应 （ 1997; 1998） 。 图 1枯菌 R. 因簇的结构图 of . 数字标注的细箭头表示 因簇的转录单元， 粗箭头表示不同的基因。灰色粗箭头表示保守的 因，黑色粗箭头表示编码分泌蛋白的基因，具有阴影的白色箭头表示调节基因。 （ 引自 et 2000） 致病蛋白 在胞外环境中发现了能通过 R. 泌系统的三种致病蛋白 ： 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 5 种致病蛋白的编码基因位于 转录调节因子 一种分子量为 33似于其它致病细菌的 其以高浓度进入植物组织后，可引起组织的类似过敏感 性反应（ et 1994）。 型分泌系统细菌致病蛋白的结构特征。 有双向核定位信号，能够使其它一些分泌蛋白转运至植物细胞内并发生作用； 024个氨基酸，携带 22个富含亮氨酸重复序列，这个重复序列类似于植物体内的某些抗性基因，说明它能够干扰植物的抗病反应。然而， 能是功能冗余作用（ 致了该现象的产生 （ et 2000） 。因此，这些蛋白在侵染植物中的作用还有待进一步验证（ 图 1 图 1R. 型分泌系统装置中不同 白的角色模式图 of rp in of 白可能用来分泌蛋白和组成 核心部分。许多 白形成细菌内膜， 泌素是外膜定位通道。推测 脂蛋白分别定位在内膜和外膜，形成 膜之间的连接物。这些复合物允许 分泌物通过，在 用下组装成 构，然后 膜复合物分泌致病蛋白，如 过 入植物细胞。 ( 引自 et 2000) rp 鞭毛附属物的另一种形态，随机附着在细菌表面。 青枯病菌致病上发挥直接的作用 ， R. 需要 泌的产物。当细菌在能诱导 因表达的选择性培养基上培养时，会出现大量的 et 1992），而在不能诱导 因表达的丰富培养基上培养时，未发现 明 因控制其产物。 主要结构由 因编码，指导分泌蛋白在植物细胞内的转运（ et 2002） 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 6 调节因子 因在植物细胞中通过 节蛋白的作用才有活性，而这种活性需 要细菌和植物细胞的相互作用，由膜外受体蛋白 因的植物调节因子 )识别（ et 2000; et 1998）。 另外两个调节因子 导植物细胞依赖接触的信号，由 节因子调控（ et 推测这种依赖接触的信号能够调节一些特殊的 型分泌蛋白进入真核生物细胞（ et 2000）。 物青枯病的防治 到目前为止，控制维管束病害的方法还很有限。虽对 青枯病的防治已进行了大量的研究，但很难找到一种有效的防治措施，目前防治青枯病主要方法体现在以下方面。 业防治 主要包括土壤添加剂的施用，土壤曝晒和蒸薰，作物轮作和套作，利用无病种苗，激素的利用和嫁接等。其中，农业轮作是防治青枯病的有效措施，但是由于我国人多地少，耕地有限，此措施运用受到极大的限制，所以此措施只是在局部地区起到作用；嫁接由于其费时费力等特点，故其推广受到了限制。 学防治 通过对土壤、植物种子或植株进行化学农药处理，可以一定的防治效果。但使用化学农药存在造成严重的污 染环境和导致病原菌产生抗药性等问题，不符合当前绿色食品或有机食品生产的需要。 病品种 目前，在花生、马铃薯、茄子上已成功地选育出了对青枯病抗性较强而稳定的品种。相比之下，番茄的抗病育种工作则显得较为复杂而艰巨。我国南方地区虽然已经选育出了一些番茄抗病品种，并在生产上推广应用，对有效防治番茄青枯病有一定作用。但因番茄青枯菌菌系分化复杂，变异能力强，各地病菌致病力差异明显，加之实验方法和选用的鉴别寄主抗性水平不同，现仅有少数省市有明确的鉴定结果，其它鉴定结果不一致。 物防治 近年来， 许多学者对青枯病生物防治方面做了大量工作，主要集中在拮抗微生物和青枯菌的无致病力突变体的利用等。随着绿色农业、无化学农药使用的提出，生物防治成为当前最有效、最经济的防治措施，下面详述番茄青枯病的生物防治。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 番茄青枯病及其防治研究现状 7 茄青枯病的生物防治 当前，生防已经成为植物病害防治研究的热点之一。番茄青枯病的生物防治措施不外乎生物制剂和生物因子两种类型。生物制剂主要为微生物制剂等；生物因子主要为促生根际微生物等有益微生物、青枯菌的诱发突变体及利用基因工程手段得到的无致病力突变体等。 物制剂 微生物制剂 魏春妹等 （ 2000）运用平皿相互拮抗筛选模型得到假单胞杆菌 90模拟生产工艺制得具有拮抗番茄青枯病的生防制剂 青枯散。田间试验证明该制剂对番茄青枯病有 70 防治效果，并有 10的左右的增产效果。 刘波等筛选获得了具有自主知识产权的植物青枯病生防菌 次发现该生防菌对青枯菌的致弱现象，即将青枯雷尔氏菌强致病力菌株转化为无致病力菌株，其致弱机理主要是通过位点竞争和抗生作用的微生态选择，能有效抑制致病菌的生长， 作物青枯病有良 好的防效，青枯病田间防效高达 75% 氨基寡糖素 氨基寡糖素是一种由海洋生物原料甲壳质中提炼得到的新型生物制剂，无毒害，不污染环境，符合当前无公害农业发展。孔德英等（ 2005）