【毕业学位论文】（Word原稿）牛乳房炎相关基因克隆、多态性研究及其与体细胞评分的相关性分析动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 牛 乳房炎相关基因克隆、多态性研究及其 与体细胞 评分 的相关性分析 of of I 摘 要 乳房炎是奶业生产中的一种常见病，不但发病率很高（ 25 60%） ，而且每年给世界各国 奶牛饲养者 造成严重的经济损失 。乳房炎的影响因素很多，但遗传因素对其起着重要作用 。 受体家族是最近新发现的一类受体家族，在动物的先天性免疫过程中发挥作用，已有研究证明 研究利用分子生物学和生物信息学相结合的方法，克隆 因 全长 列，获得 了 因和蛋白的相关信息，并采用 因的遗传变异， 选 用 般线性模型对 因第 2 外显子发现的多态位点和 3 个奶 牛品种 中国荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中国西门塔尔牛 体细胞 评分 （ 行 相关 分析，得到了如下的结果： 探针，从 查找牛同源性 这些 成的重叠群（ 计引物，并结合 术获得 因 全长 陆号是 列全长 3837含 2910放阅读框，两翼有 84非翻译区、 814非翻译区和 30bp A）。对 因推导 蛋白质 基因编码 969个 白质提交 到 站的 行蛋白质保守域的预测，结果与实际 的功能相符。 因 （ 录号： 多态性和 3 个奶牛 品种 体细胞评分 （ 关性 （ 1） 因 385 位点 析 结果表明： 385 位点 T/G 突变造成 酶切多态位点， 引起蛋白质氨基酸天冬氨酸 /谷氨酸 变化。 该 酶切 多态位点表现 为 3 种基因型 41 07 48 41 07 48此位点 中国 荷斯坦奶牛 和三河牛 A 等位 基因占优势，而中国西门塔尔牛 B 等位基因占优势。 （ 2） 因 398 位点 析 结果表明： 398 位点 存在 G/A 突变，通过创造一个酶切位点对此多态位点进行 群体 分析 。 该 酶切 多态位点表现 为 2 种基因型 0 21 19 3090 21 19 在试验的 3 个奶牛群体中未发现 因型。 此多态位点在 中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛 3 个奶牛品种中 A 等位基因占优势。 （ 3） 因 1884 位点 析 结果表明： 1884 位点 存在 G/A 突变， 引起氨基酸甘氨酸 /丝氨酸之间的变化， 通过创造一个 酶切 位点对此多态位点进行 群体 分析 。 该 酶切 多态位点表现 为 2 种基因型 1882 210882在试验的 3 个奶牛群体中同样未发现 因型。 此多态位点在中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛 3 个奶牛品种中 A 等位基因占优势。 （ 4） 群体遗传学分析表明： 中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛 3 个奶牛群体在 3个多态位点达到 衡状态， 3 个奶牛群体在 385 多态位点达到中度多态，在 398和 1884 多态位点达到低度多态。 （ 5）利用 一般线性模型，对 因第 2 外显子发现的 3 个多态位点和 3 个 奶牛 种中国荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中国西门塔尔牛 体细胞 评分 （ 进行 相关 分析。 因398 和 1884 位点不同基因型 对于 3 个奶牛品种乳房炎 异不显著 （ P， 385 位点不同基因型 对于 3 个 奶牛品种 乳房炎 异显著 （ 385is 100体积 20L 中国农业科学院硕士论文 第 二 章 材料与方法 20 表 连接反应体系 成 量（ L） L） 体 0接缓冲液 化产物 4接酶 体积 过夜（ 8取 余置于 冻存。 大肠杆菌 感受态细胞的制备（ ） 挑取 肠杆菌原种，在 脂板上划线， 37 培养过夜（ 12 挑取单菌落，接种到 100 B 液体培养基中， 37 190 转 /荡培养 12 h 当 达 摇培养基肉眼可见云雾状）时，停止培养 将菌液以 1 分装至预冷的 7菌离心管中，冰浴 10 000 离心 10 弃上清，每管用 1冷的 体中有冰粒时效果最好）重悬菌体沉淀，冰浴 304 000 离心 3 弃上清，每管用 200悬菌体沉淀，冰浴 10得感受态细胞 现制现用，或加入 30%甘油至终浓度为 15 混匀，分装成 200l/份 投入液氮快速冷冻后， 冻存 转化 将 4l 0l 匀后用三角玻棒均匀地涂布于 B 平板上 平板放入 37 培养箱中，待液体被吸干后即可用于涂布转化的细菌 从 取出冻存的感受态细胞，置于冰上解冻 中国农业科学院硕士论文 第 二 章 材料与方法 21 将 慢均匀打入 100注意动作要轻柔，冰浴 20 42 水浴热激 90s（其间勿摇晃离心 管），迅速取出置于冰上，冰浴 5 加入 800l 体培养基（不加 于 37 ,小于 150荡培养 50 复苏细胞 将离心管静置数 3 000 转离心 4-5 掉部分上清 轻柔地将细菌悬浮，涂布于选择性平板上 待液体完全渗入琼脂后，倒扣平板，于 37 恒温培养箱中培养 9时 取出置于 4 放置数 h，让蓝白斑显色明显 重组质粒 鉴定 连接转化后，为确定外源 段是否插入质粒形成重组质粒，需进行鉴定实验。鉴定方法主 要包括：菌体 定、 、酶切鉴定等。本试验主要采取菌体 定， 应体系见表 体操作步骤是： （ 1）挑取白色单菌落（一般 4），在含有 B 板上划线培养 12时挑一蓝斑做对照 。 （ 2）建立菌体 应体系：总体积 12l。 （ 3） 琼脂糖凝胶电泳检测，依据扩增片段有无和大小鉴定外源 段是否插入质粒 。 表 重组质粒 鉴定菌体 应体系 of 分 量（ l） l) 灭菌去离子水 0冲液 1.2 2.0 合引物（ 5M） 合酶（ 5U/l） 白斑培养好的菌液 国农业科学院硕士论文 第 二 章 材料与方法 22 序列测定 测定方法如 列同源性检索鉴定 通过美国国家生物技术信息中心（ ）网站的 件，将测序后获得的 列与 据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该 列的信息。中国农业科学院硕士论文 第 二 章 材料与方法 23 第三部分 基因的组织表达谱研究 组织样提取方法见 一链合成见 北京沙河 荷斯坦 成年牛卵巢、肝脏、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心脏、肺、胰脏、睾丸、乳腺组织提取的总 取1积为 50L， 其中引物 ， 转录酶 300U， 。于 37C 温育 1h 后， 95活反转录酶。 备用。反转录的具体方法参见杨金娥（ 2004）。 用牛 后用 12个牛组织的 如表 进行扩增，以便检测这 2 个基因在牛 12 个组织的表达量。 表 因表达谱分析的引物 he 因 物名称 物序列 段大小 3 203 3 5 3 230 R 5 3 表 因 表达谱分析的引物 he 因 物名称 物序列 段大小 3 222 3 5 3 230 R 5 3 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 24 第三章 结果与分析 第 一 部分 候选基因 长序列的克隆 提取效果 总 有四个亚基： 28s， 18s， 5s。由于 5s 条带分不开，因此完整的总泳检测图应有 3 条带，且 28s 条带的宽度和亮度应为 18s 的 。 本试验采用 剂盒，从牛的乳腺组织中提取总 体方法参见 甲醛变性凝胶电泳结果见图 的样品量是 228S 和 18S 条带明亮 、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且 28S 条带亮度在 18S 条带的两倍以上。经上海产 提取的总 260吸收值与 280，表明无蛋白质和其他杂质污染。因此，认为 质量是好，可以进行后继的 验。 因的 果和 列分析 将 产物纯化后，送交北京诺塞基因组研究中心有限公司进行测序。经过克隆测序验证所获得的 到该基因的全长 列。序列长为 3837将序列提交 据库，基因登陆号是 用 件中的 序分析 因的开放阅读框（ 分析其与其他物种的同源性和开放阅读框本身固有的特征，确定 因包含2910开放阅读框，两翼有 84非翻译区、 814非翻 译区和 30bp A）。 在 据库中 做 对，发现其与人 因有很高的序列相似性，达到 92%（ 与小鼠序列一致性也高达 83%（ 图 甲醛变性凝胶电泳结果 of 8s 5s 18s 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 25 因内含子和外显子的拼接位点 用 牛 因与牛的基因组序列（ 行 对，其所有序列落在牛第 6 号染色体 ，提示牛 因可能定位在牛的第 6 号染色体比对结果见图 合基因组的比 对和内含子、外显子的特征，分析得知 因有 23个外显子和 22 个内含子。拼接位点如表 图 因的电子定位 of 的 因内含子和外显子的拼接序列 of of 显子 含子 末位置 in 末位置 in 小 1 1 103291032529 3948 2 2 4099303992253 4441 3 3 11494783947379 4086 4 4 154906509054801 31943 5 5 256586045845447 11836 6 6 404466174645062 1986 7 7 567444634430060 1347 8 8 728429524284002 2419 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 26 9 9 83140420406252 2261 10 10 925383632821739 4075 11 11 1055322916212549 31652 12 12 120530472303761 1977 13 13 1297283982820378 1467 14 14 1476267352658346 3324 15 15 1623232582313815 5757 16 16 1739173801717001 604 17 17 1941165671638470 307 18 18 2111160761596500 1812 19 19 2212141521401625 1482 20 20 233812533124577 318 21 21 2406121381195772 774 22 22 2579111821100671 2577 23 27510842859 因氨基酸序列推导 因编码 969 个 件中的 电点为 件中的 序推导 因的氨基酸序列 （见图 ， 用 件进行物种蛋白间的同源比对，发现 其与人 (大鼠 ( 小鼠 （ 犬属（ 白的同源性达到 见图 。 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 27 图 因编码区序列和推导氨基酸序列 A of 国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 28 .A.的 因编码推导的蛋白质的氨基酸序列与 人 (大鼠 (小鼠（ 犬属（ 的 白质氨基酸序列的比对分析 of aa of of 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 29 导蛋白系统树构建 从 据库下载人 (大鼠 (小鼠（ 犬属（ 因编码的氨基酸序列并结合牛 因推导的蛋白质氨基酸序列，用 系统发生树（ 见 图 物种为人、牛、大鼠、小鼠和犬鼠。结果表明，牛和狗聚在一起，然后和人聚在一起；大鼠和小鼠聚在一起，说明 就 白而言， 牛和狗的亲缘关系比较近。 图 白的系统聚类树 of 导蛋白质的保守域预测 用 件中的 序推导了 白质序列，然后提交到 站的址是 ），进行蛋白质保守域的预测。 牛 因保守域预测结果见 因已知功能域见图 图 白的 保守域预测结果 .6 of 国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 30 图 白功能域 .7 of 功能域的作用如下： 同源域，含有 合区域，二聚体区域及核定位信号。蛋白质包含 有 2 个结构域， N 端结构域和 白的机构域相似， 要作用可能有三个：一是 合位点；二是锚蛋白（红细胞和脑的膜蛋白，作用为使红细胞定形素固定于阴离子通道外的质膜）结合位点；三是二聚化的界面。 蛋白重复，主要作用是调节多家族蛋白之间的相互作用。锚蛋白重复数可以从2 到 20 个不等，这里的重复数是 4 个。 死亡域：在存在有细胞凋亡的细胞蛋白中存在，它主要的结构是 分死亡域有同型或异型的二聚物结构。 第 二 部分 因 究结果 因组 提取效果 采用常规的酚 取中国荷斯坦 奶牛 、 三河牛 和 中国西门塔尔牛 3 个品种牛血液中的基因组 图 取 1l 基因组 脂糖凝胶电泳检测结果。 图 血液基因组 琼脂糖凝胶中的电泳图谱 NA 2 3 4 5 中国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 31 从检测结果可以看出，提取的基因组 一条较致密、整齐、清晰的条带，而且无拖尾、亮度也比较好，说明 完整性较好，含量较高，可用于后续试验。 因的多态性 及其与乳房炎性状的关联分析 新发现的 受体家族中的一员， 仅可对 G+菌的胞壁成分 行模式识别，还可识别完整的 G+菌，从而激活细胞内信号传导机制，产生先天性免疫。本研究将 用表 描整个 录号： 因的 385 位点、 398 位点、 1884位点发现 3 个可以群体遗传学分析的 T/G 、 A/G 、 A/G 碱基替换，并与奶牛乳房炎性状进行关联分析。 因 385 位点多态性及其与乳房炎性状的关联分析 因 385 位点测序结果及分析 随 机取中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛基因组 品，根据表 物行扩增，产物回收后直接测序。用 件中的 序进行比对结果见图 因的 385 位点发现了一个 T/G，引起了蛋白质氨基酸天冬氨酸 /谷氨酸的变化，导致等位基因 A 变成了等位基因 B。 385 位点 图 因 385 位点测序结果比对 of 85 国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 32 因 385 位点 增结果 根据 因（ 录号： 列设计该位点的特异性引物，如表 1扩增片断为 因的 691 1138第 2 外显子上的片断，共 448位点的扩增产物如图 示，扩增片断明亮、特异性好，可以进行后继试验。 因 385 位点酶切电泳结果 经分析 因 385 位点的突变可以用 进行酶切检测多态性。在扩增的 448的酶切位点，酶切片断大小分别为 44841207 本研究采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测酶切结果使酶切的图片更清楚 。酶切结果显示在 385位点有三种基因型， 4107 484107 48该结果证实了在 385点处存在的 T/G 突变。图 酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 图 因 385 位点扩增结果 85 1 2 3 4 5 6 7 448 1 2 3 4 5 图 10% 聚丙烯酰胺凝胶分析 酶切 CR 0% 691268国农业科学院硕士论文 第 三 章 结果与分析 33 因 385 位点的基因型频率、基因频率分析 由表 以看出， A 等位基因在所在的中国荷斯坦奶牛、三河牛 2 个奶牛群体中频率高于 B 等位基因，而在中国西门塔尔牛群体中基因频率略低于 B 等位基因； 因型在中国荷斯坦奶牛、三河牛 2 个群体 中最低，而在中国西门塔尔牛群体中 因型频率最高。 表