1挑战杯资料 大挑 2007年挑战杯广东大学生课外学术科技作品竞赛 参加省赛作品2007-03 蜂毒素

序号： 编码： 第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称：蜂毒素对红细胞G-6-PD和Na-K-ATP酶的生化作用机理研究 学校全称：华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）：李日清 陈柏刚 林先丰 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A1申报者情况（个人项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写 个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）； 2本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。姓 名李日清性别男出生年月1985年1月申报者情况学校全称华南农业大学专 业生物技术现学历本科年级2003级学制 4年入学时间2003年9月作品全称蜂毒素对红细胞G-6-PD和Na-K-ATP酶的生化作用机理研究毕业论文题目通讯地址广州市华南农业大学生命科学学院03级生物技术2班邮政编码510642单位电话85280185常住地通讯地址广州市华南农业大学华山学生宿舍区17栋305邮政编码510642住宅电话38676756合作者情况姓 名性别年龄学历所在单位陈柏刚男22本科华南农业大学生命科学学院林先丰男22本科华南农业大学生命科学学院资 格 认定学校学籍管理部门意见 是否为2006年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校中国学生（含专科生、本科生和研究生）。是 否若是，其学号为：2003370209 （部门盖章） 年 月 日院系负责人或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果 是 否 负责人签名： 年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（ D）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路目的：蜂毒素（Melittin,一种小分子抗菌肽）是新一代无耐药性抗生素的热点候选分子，具有很强的抗菌和抗病毒作用，但因其溶血副作用而限制了其应用，消除其溶血活性是当前研究的方向与重点。已有研究认为蜂毒素溶血作用以其质膜活性为基础，其溶血活性的生化机理尚不清楚，不能全面阐明蜂毒素的溶血机理。本作品研究蜂毒素对红细胞膜酶和胞质酶的生化作用机理，从生化角度阐明蜂毒素的溶血机理，结合蜂毒素的分子空间结构及生化特性分析，探索其溶血活性的分子基础及生化基础，为蜂毒素分子改造及其溶血活性的消除提供理论依据和有益参考。基本思路： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）是磷酸戊糖途径(HMP)的限速酶，能催化产生红细胞还原当量NADPH，而保护红细胞免受氧化损伤；钠钾ATP酶（Na-K-ATPase）是红细胞膜上重要的ATP酶，维持红细胞的渗透性和静息电位、保持细胞体积及可塑性，这两种酶在血红细胞稳定、避免溶血中起着关键作用。以G-6-PD和Na-K-ATPase为研究对象，分光光度计连续反应法检测G-6-PD活性，磷钼蓝法检测Na-K-ATPase活性，分别研究反应系统加入蜂毒素前后、以及多组反应条件下G-6-PD和Na-K-ATPase活性的动态变化，绘制反应曲线，推导蜂毒素对G-6-PD和Na-K-ATPase的抑制方式，以及相互作用的基本过程,探索蜂毒素溶血活性的分子基础和生化基础。作品的科学性、先进性及独特之处科学性：1. 以维持血红细胞稳定的关键膜酶和糖代谢途径中限速酶作为研究对象，研究蜂毒素与两者的作用机理，揭示蜂毒素溶血活性的分子和生化基础。2. 设定具有对照性的多组反应条件设定蜂毒素加入反应系统的时间（反应开始前、开始时、开始后）；设定蜂毒素浓度梯度；设定蜂毒素、底物、辅酶的不同混合组合；等，确定蜂毒素作用于酶的可能部位（底物、辅酶、酶的催化位点等）以及不同蜂毒素浓度的作用效果。3. 根据动态监测酶活性变化，以宏观变量的动态变化推导蜂毒素作用于酶的微观过程，获得蜂毒素作用于G-6-PD和Na-K-ATPase的基本过程。先进性：1. 实验方法的创新1.1 通常用荧光斑点试验或测定设定时间内光吸收值的增量来检测G-6-PD活性（静态测定）。本研究连续测定光吸收值的变化（动态测定），从宏观变量变化获得蜂毒素作用过程的微观进程的信息。1.2 Na-K-ATPase测定前制备红细胞膜材料，存在膜材料粘稠难以定量问题，通过定量红细胞悬液之后制备膜材料，解决膜材料定量问题。2. 理论研究的创新2.1 发现EDTA抑制蜂毒素四聚体形成，强烈解离已组装的四聚体，为蜂毒素的研究发掘了工具性的试剂。2.2 发现蜂毒素以自身正电荷静电结合红细胞内含磷酸根（带负电荷）的分子（ATP、NADP、G-6-P等），导致红细胞代谢干扰现象。独特之处： 目前研究认为蜂毒素作用于细胞质膜，增加质膜透性、形成穿膜环形孔洞（Toroidal Pores），致使细胞内含物渗漏，导致溶血。（Oren Z, Shai Y.1997； Daniel Allende, S.A.Simon, 2005）一般从蜂毒素膜活性方面解释蜂毒素的溶血机制，而蜂毒素与血红细胞膜酶以及胞内糖代谢酶的作用关系目前尚未深入研究。本作品从生化角度出发，研究蜂毒素与血红细胞膜酶Na-K-ATPase及HMP限速酶G-6-PD的作用关系和机理，探究蜂毒素对血红细胞膜酶及胞内糖代谢酶的生化影响，试图阐明蜂毒素溶血作用的生化机理，找出其溶血活性的分子及生化基础。作品的实际应用价值和现实意义蜂毒素以优良广谱抗菌性及不易引发细菌抗药性的特点，成为目前新一代无耐药性抗生素研究中的热点候选分子。蜂毒素开发为新一代无耐药性抗生素研究的关键是消除其溶血活性。阐明蜂毒素溶血机理是其分子改造、消除溶血作用和构建基因工程表达菌实现量化生产的基础。本研究试图阐明蜂毒素溶血作用的生化机理，找出其溶血活性的分子及生化基础，从而为其溶血活性的消除提供必要的理论依据。同时蜂毒素对血红细胞膜酶、胞质酶的生化作用关系研究也将为其临床医学研究提供有益的参考。学术论文文摘采用分光光度计随时间连续检测NADPH和钼蓝法测定无机磷，研究了蜂毒素对血红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）和Na+-K+-ATP酶（Na-K-ATPase）的相互作用机理以及这种作用与蜂毒素溶血活性的关系。在不同浓度梯度下测定G-6-PD活性，发现蜂毒素抑制G-6-PD活性，当其浓度达到或大于10mmol/L时强烈抑制，加入EDTA可迅速解除部分抑制。反应启动前和反应启动时两个时刻加入蜂毒素，G-6-PD活性无明显差异，说明蜂毒素对G-6-PD二聚体本身无破坏作用。底物葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）或辅酶NADP与蜂毒素混合后加入反应系统均出现G-6-PD活性检出滞后现象，表明蜂毒素与G-6-P及NADP都具有亲和性，它是通过与G-6-PD竞争底物及辅酶来抑制G-6-PD活性的。 蜂毒素带正电荷（含6个带正电荷氨基酸残基Gly1, Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24），这些带正电荷基团与G-6-P、NADP具有静电结合作用。当蜂毒素浓度10mmol/L时形成四聚体，静电结合能力急剧增加，EDTA阻止蜂毒素四聚体的形成从而部分解除其对G-6-PD的抑制作用。对Na-K-ATPase活性的研究发现，在蜂毒素附着血红细胞质膜或游离于反应溶液的反应条件下，Na-K-ATPase活性均受到抑制，后者的抑制可通过加入EDTA得到部分解除。 蜂毒素一方面插入质膜促使Na-K-ATPase二聚体解离，破坏酶结构，另一方面与ATP存在静电吸引，跟Na-K-ATPase竞争底物，抑制其活性，从而引起红细胞内离子环境失衡。蜂毒素以其较强的正电荷静电结合红细胞内含磷酸根的带负电荷分子，抑制HMP途径，干扰糖代谢。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励本研究是华南农业大学2006年大学生科技创新活动中的立项项目。鉴定结果 研究顺利进行，获得预期成果，初步阐明melittin对血红细胞G-6-PD及Na-K-ATPase的生化作用机理，以及该机理的生化基础。Melittin对G-6-PD二聚体本身没有直接破坏作用，而是通过其正电荷吸附辅酶NADP及底物G-6-P来抑制G-6-PD的活性，阻碍红细胞HMP途径，并对EMP途径产生干扰。Melittin一方面以其膜活性破坏红细胞质膜完整性而破坏Na-K-ATPase，同时也通过其自身正电荷吸附底物ATP来抑制Na-K-ATPase的活性，引起红细胞内外离子失衡。melittin与G-6-PD及Na-K-ATPase的作用都是与其自身所带正电荷密切相关的。请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录WANG GL, XING Z. Current Status and Prospect of Melittin StudyJ. Journal of Liaoning Normal University(Natural Science Edition), 2005，28(1):87 91 Li C, Huang PT. Brand-new Antibiotics: Progress of Antimicrobial Peptide StudyJ. World Notes on Antibiotics, 2004, 25(3):109 112 LI DL,WANG GL,FANG HJ. Progress in studies of MelittinJ. Chin JMAP.,2003, 20(2): 114-116 游育红 黄自强. 蜂毒素（melittin）的心血管作用J. 中国药理学通报. 1994,10(4):256-258 Ling CQ, Huang XQ, Liu L. The anti-tumor effect of melittin in vitroJ. Acad J Sec Mil Med Univ, 2001,22(7): 612 615 Wachinger M, Kleinschmidt A, Winder D. Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression J. J Gen Virol , 1998,79(4):731740 Bonomo R A. Multiple antibiotic-resistant bacteria in long-term-carefacilities: an emerging problem in the practice of infectious diseases J. Clin Infect Dis, 2000, 31:1414 Wong A H, Wenzel R P, Edmond M B. 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Deletion of two C-terminal Gln residues of 1226-residue fragment of melittin improves its antimicrobial activityJ. Peptides, 2005,26 : 369375. Perez-Paya E, Houghten RA, Blondelle SE. Determination of the secondary structure of selected melittin analogues with different haemolytic activitiesJ. Biochem. J., 1994,299:587591李建新，魏尧梅，许文生，等. 人红细胞膜Na-K-ATPase的研究J. 第二军医大学学报，1983,4(4):275280 丛玉隆，殷宗健，张立交，等. 贫血、血栓及遗传学检验技术与临床M. 天津科学技术出版社，2002:66-68 Lanzetta PA, Alvarez LJ, Reinach PS, et al. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphateJ. Anal Biochem, 1979, 100(1): 95 Vulliany T et al. Curr Trends Genet, 1992,8: 138 Han XH, Sui SF. The Self-association of Melittin at Low Concentration In Aqueous SolutionJ. ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA, 1996, 28(3):307 311 Terwilliger C. T and Eisenberg D. The Structure of MelittinJ. The Journal of biological chemistry,1982,Vol(257):6016-6022Hamdi GS, Nazmi ZER. On The Kinetics of Human Erythrocyte Glutathione Disulfide Reductase: Does The Enzyme Really Play Ping-Pong? J. Tr. J. of Biology, 1999,23: 143-151 Skou JC, Esmann M. The Na-K-ATPaseJ Bioenerg Biomembr, 1992, 24:249-261 Aslihan Aydemir KKsoy. Na-K-ATPase: A ReviewJ JouRnal of Ankara Medial School. 2002,Vol(2): 73-82 徐文琳. Na-K-ATPase研究进展J 国外医学生理、病理科学与临床分册. 2003，Vol(5):531534 Mara J. Gomaraa, Shlomo Nirb, Jose L. Nieva. Effects of sphingomyelin on melittin pore formationJ. Biochimica Biophysica Acta, 2003 ,1612: 83 89申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）蜂毒素对红细胞G-6-PD和Na-K-ATP酶的生化作用机理研究科研管理部门签章 年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。蜂毒素（melittin）是一种由26个氨基酸残基组成的两亲性螺旋抗菌肽（antimicrobial peptide）分子，是蜂毒（bee venom）中的主要成分（Habermann eatal., 1967; Terwilliger etal., 1982; Bazzoetal., 1988），其分子量为2840D。国内外已有研究表明，蜂毒素具有极强的广谱抗菌消炎活性，能结合到磷脂膜上，裂解各种类型的细胞和脂质体，抗电离辐射、抗肿瘤以及免疫调节的功能（王关林2005），另外还有抗艾滋病的作用（Wachinger M, Kleinschmidt A, Winder D，1998）。一定浓度的蜂毒素在一定溶液环境中自组装成为寡聚体，因为其结构相对简单，成为了蛋白质自组装过程研究的模式分子之一（Pu Liu, Xuhui Huang, Ruhong Zhou & B. J. Berne，2005）。随着传统抗生素广泛使用，出现了细菌耐药性，耐药菌株愈来愈多，甚至出现能对抗所有抗生素的耐药菌（Bonomo R A.，2000）。研发具有抗耐药菌的新一代抗生素已经是迫切的课题。抗菌肽因不易诱发细菌耐药性而有望替代传统抗生素，成为新一代抗生素（Li C, Huang PT.，2004）。蜂毒素因其生物活性高，且结构特殊，已经成为生物学界研究这类抗菌物质的模式材料。然而蜂毒素具有溶血副作用，极大地限制了其在医药方面的应用。在蜂毒素抗菌机制和溶血机理研究的基础上，通过生化或基因工程手段改造蜂毒素分子以保留其抗菌活性和消除其溶血活性已成为研究热点（Sylvie E.，1991；C.Subbalakshmi,1999；Xuejun Sun,2005 Igor Zelezetsky,2006；）。蜂毒素的溶血机理的研究是其分子改造的理论基础。目前主要通过蜂毒素与红细胞质膜的作用关系来研究其溶血机理，研究认为蜂毒素在红细胞膜上形成环形空洞（toroidal pore）（Perez-Paya E,1994；Igor Zelezetsky,2006），同时还可以通过激活红细胞膜上的磷脂酶而降解膜脂，从而造成溶血（Sylvie E.，Blondelle and Richard A.，1991）。但是蜂毒素与红细胞膜上以及细胞内重要酶的作用关系目前还没有深入研究，使得蜂毒素溶血机理尚不完备。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名杨跃生性别男年龄49职称研究员工作单位华南农业大学生命科学学院通讯地址广州市 天河区 五山路483号华南农业大学生命科学学院邮政编码510642单位电话85280196住宅电话85283369推荐者所在单位签章 （签章） 2007年 2 月 28 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述李日清等同学申报的创新课题：蜂毒素对红细胞G-6-PD和Na-K-ATP酶的生化作用机理研究在华南农业大学生命科学学院生化与分子生物学研究室完成，期间做了大量的预试和摸索，历时近一年，最终得到了具有一定创新性的结果。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价蜂毒素是一种很有价值的多肽类抗生素，但也有些细胞毒性，本作品就怎样降低其毒副作用的生化机理展开了深入研究。该作品具有重要的研究和应用价值，以及很高的技术水平。对蜂毒素与红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶的生化作用机理，之前未见报道有人研究。其它说明推荐者情况姓 名黄卓烈性别男年龄56职称教授工作单位华南农业大学生命科学学院通讯地址广州市天河区五山邮编510642单位电宅电荐者所在单位签章 签章日期 2007年 3 月 2 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述本项目实验方案较正确，试验设计合理，所得试验结果能反映规律性，可信性强。特推荐参加挑战杯评审。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 本项目研究了蜂毒素对糖代谢中重要的两个酶（葡萄糖6磷酸脱氢酶、Na+-K+-ATP酶）的作用效果，实验结果表明，蜂毒素能明显降低此两个酶的催化活性，由此说明，蜂毒素的作用机制可能就是抑制糖代谢的进行。这可部分解释蜂毒素的作用机理。实验结果还发现，在反应体系中加进EDTA后，可部分解除蜂毒素对两酶的抑制作用。本实验结果在理论上有意义。其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处 蜂毒素对红细胞G-6-PD和Na-K-ATP酶的生化作用机理研究李日清，陈柏刚，林先丰赵亚华（华南农业大学生命科学学院，广州，510642）摘 要：采用分光光度计随时间连续检测NADPH和钼蓝法测定无机磷，研究了蜂毒素与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）和Na+-K+-ATP酶（Na-K-ATPase）的相互作用机理以及这种作用与蜂毒素溶血活性的关系。在不同浓度梯度下测定G-6-PD活性，发现蜂毒素抑制G-6-PD活性，当其浓度达到或大于10mmol/L时强烈抑制，加入EDTA可迅速解除部分抑制。反应启动前和反应启动时两个时刻加入蜂毒素，G-6-PD活性无明显差异，说明蜂毒素对G-6-PD二聚体本身无破坏作用。底物葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）或辅酶NADP与蜂毒素混合后加入反应系统均出现G-6-PD活性检出滞后现象，表明蜂毒素与G-6-P及NADP都具有亲和性，它是通过与G-6-PD竞争底物及辅酶来抑制G-6-PD活性的。 蜂毒素带正电荷（含6个带正电荷氨基酸残基Gly1,Lys7,Lys21,Arg22,Lys23,Arg24），这些带正电荷基团与G-6-P、NADP具有静电结合作用。当蜂毒素浓度10mmol/L时形成四聚体，静电结合能力急剧增加，EDTA阻止蜂毒素四聚体的形成从而部分解除其对G-6-PD的抑制作用。对Na-K-ATPase活性的研究发现，在蜂毒素附着血红细胞质膜或游离于反应溶液的反应条件下，Na-K-ATPase活性均受到抑制，后者的抑制可通过加入EDTA得到部分解除。 蜂毒素一方面插入质膜促使Na-K-ATPase二聚体解离，破坏酶结构，另一方面与ATP存在静电吸引，跟Na-K-ATPase竞争底物，抑制其活性，从而引起红细胞内离子环境失衡。蜂毒素以其较强的正电荷静电结合红细胞内含磷酸根的带负电荷分子，抑制HMP途径，干扰糖代谢。关键词： 蜂毒素 G-6-PD Na-K-ATPase 活性检出滞后 膜活性 静电作用 代谢干扰中图分类号：Q74 文献标识码：AMechanism of the interaction between melittin and G-6-PD&Na-K-ATPaseRiQing Li, BaiGang Chen, XianFeng Lin, (South China Agricultural University, College of Life Science, GuangZhou, 510642)Abstract: The article has studied the mechanism of the interaction between melittin and G-6-PD & Na-K-ATPase by checking NADPH incessantly with spectrophotometer and checking Pi with Molybdenum-blue Spectrophotometry, then explored the relation between the mechanism and the effects of hemolysis of melittin. It shows that melittin restrains G-6-PD. G-6-PD is restrained seriously when the concentration of melittin reaches or exceeds 10mmol/L. However, the restraining weakens quickly if EDTA is added in. Melittin will not damage the dimmer of G-6-PD. There is lag of active mensuration when G-6-P or NADP is mixed with melittin and added in reactive system, which illuminates that there is affinity between melittin and G-6-P and NADP separately, and melittin restrains G-6-PD by competing G-6-P and NADP. Melittin is positive charged (there are six positive charged amino acid residues: Gly1, Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24). There is appetency between these amino acid residues and G-6-P and NADP. Tetramers are formed when the concentration of melittin is higher than 10mmol/L, leading rapid raise of the static appetency. EDTA can prevent or check the forming of melittin tetramers. In addition, the study of Na-K-ATPase shows that Na-K-ATPase is restrained when melittin inserts in the plasma membrane of erythrocytes or when melittin is dissociative, and the latter restraining will be weakened when EDTA is added in. melittin can inserts in the plasma membrane of erythrocytes, which leads to the breakage of Na-K-ATPase. On the other hand, melittin statically attracts ATP and restrains Na-K-ATPase.Key words: melittin； G-6-PD； Na-K-ATPase； lag of active mensuration； membrane active； static action； metabolizable interfere 蜂毒素（melittin）是一种由26个氨基酸残基组成的两亲性螺旋抗菌肽（antimicrobial peptide）分子，是蜂毒（bee venom）中的主要成分（Habermann eatal., 1967; Terwilliger etal., 1982; Bazzoetal., 1988），其分子量为2840D。蜂毒素具有极强的广谱抗菌消炎活性，能结合到磷脂膜上，裂解各种类型的细胞和脂质体，抗电离辐射以及免疫调节的功能15，另外还有抗艾滋病的作用6。随着传统抗生素广泛使用，出现了细菌耐药性，耐药菌株愈来愈多，甚至出现能对抗所有抗生素的耐药菌7,8。研发具有抗耐药菌的新一代抗生素已经是迫切的课题。抗菌肽因不易诱发细菌耐药性而有望替代传统抗生素，成为新一代抗生素2。蜂毒素因其生物活性高，且结构特殊，已经成为生物学界研究这类抗菌物质的模式材料。然而蜂毒素具有溶血副作用，极大地限制了其在医药方面的应用。在蜂毒素抗菌机制和溶血机理研究的基础上，通过生化或基因工程手段改造蜂毒素分子以保留其抗菌活性和消除其溶血活性已成为研究热点913。蜂毒素的溶血机理的研究是其分子改造的理论基础。目前主要通过蜂毒素与红细胞膜的作用关系来研究其溶血机理，研究认为蜂毒素在红细胞膜上形成环形空洞（toroidal pore）12，14，同时还可以通过激活红细胞膜上的磷脂酶而降解膜脂，从而造成溶血11。但是蜂毒素与红细胞膜上以及细胞内重要酶的作用关系目前还没有深入研究，使得蜂毒素溶血机理尚不完备。笔者通过研究蜂毒素对红细胞膜酶和胞质酶的生化作用机理，从生化角度阐明其溶血机理，探索其溶血活性的分子基础，为蜂毒素分子改造、溶血活性消除提供理论依据。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）是磷酸戊糖途径(HMP)的限速酶，能催化产生红细胞还原当量NADPH，而保护红细胞免受氧化损伤；钠钾ATP酶（Na-K-ATPase）是红细胞膜上重要的ATP酶，维持红细胞的渗透性和静息电位、保持细胞体积及可塑性，这两种酶在血红细胞稳定及避免溶血中起着关键作用。以G-6-PD和Na-K-ATPase为研究对象，分光光度计连续反应法检测G-6-PD活性，磷钼蓝法检测Na-K-ATPase活性，分别研究反应系统加入蜂毒素前后、以及多组反应条件下G-6-PD和Na-K-ATPase活性的动态变化，绘制反应曲线，推导蜂毒素对G-6-PD和Na-K-ATPase的抑制方式，以及相互作用的基本过程,结合蜂毒素、G-6-PD和Na-K-ATPase三者的结构信息及生化特性，推演蜂毒素作用于G-6-PD和Na-K-ATPase的分子机理。1.材料与方法1.1 材料 新鲜肝素（Heparin）抗凝鸡血（每100ml血液加入20mg肝素）1.2 方法 1.2.1 红细胞悬液的制备 取新鲜的肝素抗凝鸡血，4 3000rpm 离心20min，去上清及沉淀表面绒毛状物质。沉淀用4预冷生理盐水悬浮，4 5000rpm 离心15min，去上清，如此洗涤3次。取血红细胞，以4预冷生理盐水制成5红细胞悬液，4保存（可稳定一周）。1.2.2 溶血素的制备 取10ml 5%红细胞悬液，4 5000rpm离心10min，去上清，沉淀用9.5ml 4预冷双蒸水（每100ml加入5l -巯基乙醇）溶解，即可得到1：20溶血素，4保存（不宜超过8h）。1.2.3 红细胞膜的制备15 取肝素抗凝全血，4 1000rpm 离心5min，弃血浆，再用4生理盐水悬浮红细胞，4 3000rpm离心20min，弃上清，如此反复洗涤3次。按1：15加入4预冷10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）缓冲液溶血30min。4，12000rpm离心10min，去上清，洗涤沉淀，反复4次，得到白色膜沉淀，用0.75mmol/L蔗糖制成膜制剂溶液，用改良Lowry法测定蛋白浓度，-20贮藏。1.2.4 G-6-PD活性的测定方法16 反应体系含Tris-HCl（pH8.0）0.1mol/L，EDTA 0.5mmol/L,MgCl2 0.1mmol/L, NADP 0.2mmol/L, G-6-P 0.6mmol/L, 1:20溶血素40l，以蒸馏水补充至总反应体系为2000l。测定时，体系先不加G-6-P（或NADP），37 温育10min后加入G-6-P（或NADP）启动反应，37 340nm波长下测定光吸收值（与NADPH生成量成正比），每30s读数一次。蜂毒素直接加入反应体系中，或者与G-6-P（或NADP）混合，启动反应，对比不同设置对G-6-PD活性的影响。以上各组试验均经三次平行重复，数据计算后取其平均值。1.2.5 Na-K-ATPase活性的测定方法171.2.5.1 标准曲线的绘制 以500mol/L KH2PO4为标准溶液，梯度稀释后，各取200l加入定磷液（2.5钼酸铵：17硫酸：10抗坏血酸：H2O=1:1:1:2）800l,56水浴10min。稀释4倍测定D660nm值，绘制D值与磷（Pi）浓度关系的标准曲线。1.2.5.2 Na-K-ATPase活性测定 反应体系终体积为600l，含NaCl 60mmol/L, KCl 10mmol/L, MgCl2 1.5mmol/L, Tris-HCl(pH7.4) 60mmol/L, ATP-Na2 2mmol/L, 膜制剂100l。测定时设置两个反应系统。第一反应系统加入乌本苷（Ouabain，终浓度为0.5mmol/L）, 第二反应系统不加入乌本苷。启动反应后，两个系统同时置37水浴40min，用三氯乙酸（TCA）300l终止反应。各取反应液200l加入800l定磷液，56水浴10min，冷却后稀释4倍测定D660nm值，在标准曲线中查出相应的Pi浓度，不含乌本苷与含乌本苷系统的Pi生成量差值即为Na-K-ATPase的酶活力。以上各组试验均经三次平行重复，数据计算后取其平均值。2.结果与分析2.1 蜂毒素与G-6-PD作用关系研究G-6-PD是红细胞磷酸戊糖（HMP）途径中的限速酶，由两个亚基构成的二聚体 18 ，在底物葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）与辅酶NADP存在的条件下，可将NADP还原为NADPH，同时生成6-磷酸葡萄糖酸。测定NADP被还原为NADPH的速率，可换算出G-6-PD的活力。NADPH生成量与G-6-PD活性成正相关，可表征G-6-PD活性变化情况（E=（100AVc ）/（6.22VHHb），其中A：在340nm每分钟的吸光度变化；Vc：测定体系的总体积；VH：加入的溶血素的量；6.22：1mmol的NADPH在340nm的吸光度值；Hb：溶血素的血红蛋白浓度）16。对比体系加入与不加入蜂毒素（其在反应体系中的终浓度为1.76mol/L）时NADPH的生成速率（操作见表1），发现反应体系中存在1.76mol/L melittin时，40min内G-6-PD活性下降了18.3，同时出现G-6-PD检出滞后的现象（见图1），图中可看到活性检出滞后时间约为2min。表1. G-6-PD活性的测定Tab.1 The mensuration of G-6-PD active试剂(l) a b c1M Tris-HCl(pH7.4) 200 200 2005mM EDTA 200 200 2002mM NADP 200 200 2001mM MgCl2 200 200 2001:20溶血素 40 40 40蒸馏水 960 860 860 37温育10min6mM G-6-P 200 2006mM G-6-P与35M Melittin 2：1混合液 300 35M Melittin 100a组为对照，不含melittin；b组melittin和G-6-P混合； c组melittin与G-6-P不混合。各试剂加于石英比色杯中，反应启动后马上读取光密度值。a