第一部分 尼克酰胺转甲基酶（nnmt）在人肾癌组织中表达情况的研究第二部分 针对plk1的sirna对结肠癌细胞sw480作用研究（可编辑）

第一部分尼克酰胺转甲基酶（NNMT）在人肾癌组织中表达情况的研究第二部分针对PLK1的SIRNA对结肠癌细胞SW480作用研究浙江大学硕士学位论文第一部分尼克酰胺转甲基酶NNMT在人肾癌组织中表达情况的研究第二部分针对PLK1的SIRNA对结肠癌细胞SW480作用的研究姓名符芳芳申请学位级别硕士专业肿瘤学指导教师丁佳逸20060501浙江大学硕士研究生毕业论文尼克酰胺转甲基酶在人肾癌组织中表达情况的研究针对的对结肠癌细胞作用的研究浙江大学医学院肿瘤学硕士研究生符芳芳导师丁佳逸第一部分尼克酰胺转甲基酶在人肾癌组织中表达情况的研究中文摘要我们以往用基因芯片技术对肾癌进行研究时发现,一种本来只有在肝脏中以较高水平表达的尼克酰胺转甲基酶蛐胁仃在肾癌组织中有着极高的表达,而在癌旁组织中表达较低,两者的差别高达倍该酶在肾癌组织中的表达水平之高可与肿瘤细胞的看家基因的表达水平相当。为了进一步探讨此酶在在肾癌中高表达的意义,本课题针对的结构和表达量作了研究,由于我们基因芯片所用的探针序列仅为序列的端部分,所以我们设计了可以扩增心全长的引物,构建了含全长片段的克隆,证明了肾癌组织中存在着完整的浙江大学硕士研究生毕业论文表达,并利用和免疫组化进一步分析了蛋白在肾癌组织中的表达情况。方法与结果采用和克隆方法检测了基因在肾脏组织中的表达。为了避免污染对实验结果的影响,用于扩增的的上下游引物分别设计在第一和第三个外显子上,之间相隔两个内含子序列。结果显示肾脏组织中有基因的完整州的表达,其核苷酸序列与肝组织同源。采用方法检测人肾癌组织和癌旁组织中蛋白表达水平的差异。以作为内参照,结果显示肾癌组织中蛋白含量高于癌旁组织。采用常规的免疫组化方法对肾癌组织进行染色。检测人肾癌组织和癌旁组织中的蛋白表达情况,研究它在肿瘤细胞中表达水平及亚细胞定位,并且比较其与正常细胞中的差异。因为要避免肾脏组织内源性生物素较丰富引起的非特异性染色,二抗采用辣根过氧化物酶标记。结果显示蛋白在肾癌组织中有着极高的表达,它在细胞中的高表达分布呈弥漫性,在胞浆和胞核均有表达在癌旁的对照肾组织中只有肾小管上皮细胞有较低水平的表达,在肾小球没有表达。结论、肾癌组织中存在基因的表达,即存在完整的仃分子。且半定量结果发现肿瘤组织表达水平高于癌旁组织。、肾癌组织中蛋白含量高于癌旁组织。、蛋白在肾癌组织中有着极高的表达,且胞浆和胞核均有阳性染色,在癌旁的对照肾组织中只有肾小管上皮细胞有较低水平的表达,在肾小球没有表达。关键词尼克酰胺转甲基酶,肾癌,、克隆,免疫组化浙江大学顶士研究生毕业论文眦仃,幽,曲,血、虢丘,柚啪、曲,血如一而如诚聃。忸咖,印猷仃曲虢丹,”塑垩查兰塑主婴塞生望些笙奎乙舶一矗白、曲肌,砌町浙江大学硕士研究生毕业论文前言目前认为,肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程,实际是多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。要了解整个癌变过程中的基因改变,以及致癌的各个阶段中细胞全部基因表达的动态变化,需要研究的不是一个或几个基因,而是整个基因组在从正常到癌的各个阶段中上千个基【司表达的动态变化。肾癌,是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率约占全身恶性肿瘤的。近年来全世界的发病率呈明显增高的趋势,每年死于肾癌者近,例”。肾癌具有遗传性和散发性二种发病形式,遗传性肾癌约占全部肾癌的。在某些遗传性病中存在特定病理类型肾癌的高发现象,这种现象为探讨肾癌的发病机制提供了重要的线索。通过对这些遗传病家族的连锁分析,可以较容易地发现致病基因,这些基因不但与遗传性肾癌的发病有关,而且可能在相同类型的散发性肾癌的发生中起到重要的作用。因此对遗传性肾癌的基因研究对阐明肾癌的发病机制有十分重要的意义。目前研究已发现多种肾癌相关基因,主要分为以下几类肾癌细胞特异性表达的基因,如,基因等非特异性基因,包勤,等以及辅助性基因,如,等。这些肿瘤相关基因与肾癌的发生,病程发展以及预后都有密切的关系。其中肾癌组织特异性表达的基因更可作为临床上重要的诊断因子,发挥重要的作用。但是遗传学研究证明肾癌是多基因相关肿瘤,发病机制复杂,为此,鉴定并克隆出新的肾癌的特异性或相关性基因将为临床提供必要的诊断指标和治疗标准。寻找和克隆肿瘤相关基因一直是一个世界范围的大课题。一种新的分子生物学分析技术基因芯片可以进行高通量的生物信息处理,确定基因表达谱,样品用量极少,自动化程度高,大大提高了发现肿瘤相关基因的效率。该技术在肿瘤基因谱的确定、基因突变及多态性分析、肿瘤的基因分类、抗肿瘤药物的筛选及临床判断预后等领域已显示出重要的理论和实际应用价值。尤其是在寻找肿瘤相关基因方面,基因芯片可以对来源于不同个体、不同细胞周期、不同分化阶段、不同病变、不同状态和程度的肿瘤组织或细胞内的进行检测,能迅速将某些基因与肿瘤联系起来,缩短了实验周期,大大加快了这些基因功能的确定。目浙江大学硕士研究生毕业论文前已有许多研究利用该技术发现多个与肝癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌等相关的基因“”。我们过去用基因芯片对大量肾癌和癌旁组织进行了大规模基因表达的研究后发现,一种本来只有在肝脏中表达的尼克酰胺转甲基酶锄在肾癌组织中有着极高的表达,与癌旁组织中的表达水平差别高达倍。同时对肺癌、肝癌、乳腺癌的基因芯片数据的删表达进行分析后发现,在这些肿瘤组织中的表达水平不比癌旁组织增加。人类是年在肝脏组织中被克隆的”,后来发现其基因位于号染色体的短臂,它有三个外显子和两个内含子组成,由此基因编码的舱分子长度为个核苷酸,其编码的蛋白质长度为个氨基酸,分子量为。与疾病关系的报道较少,大部分集中于其与帕金森症之间的关系】勤。近来越来越多的研究表明,陋仃与癌症有关。有研究发现在甲状腺癌组织中的表达水平要比癌旁组织增加”,但对在甲状腺癌组织中高表达的作用和意义并没有深入研究。列烈等利用二维凝胶电泳和质谱分析发现,本来作为胞浆蛋白的在大肠癌患者的血清中以分泌型存在,可以作为大肠癌的一种血清标志物。最新的研究与我们的发现有相似的报道,等利用基因芯片对例肾透明细胞癌组织进行基因表达分析后也发现了证在肾癌组织中以高表达水平。但是没有进步分析蛋白的表达水平及其在组织细胞中的分布特征。因此,到目前为止,在肾癌中的表达的变化和意义方面的研究还是空白。我们已经完成的工作已经发现在肾癌组织中高表达,因此我们进一步深入研究了蛋白的表达情况及亚细胞定位,试图通过更多信息证明与肾癌之间的关系,并推论和解释在肾癌的病理过程中的作用。浙江大学硕士研究生毕业论交实验材料一、实验试剂,上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司酶一连接酶上海生工生物工程公司腩上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司琼脂糖溴化乙锭】上海生工生物工程公司三羟甲基氨基甲烷“乙二胺四乙酸上海生工生物工程公司。十二烷基硫酸钠大连宝生物工程公司产物回收试剂盒华美生物工程公司异丙基硫代一一半乳糖苷华美生物工程公司溴氯一吲哚半乳糖苷胰蛋白胨酵母提取物饱和酚上海生工生物工程公司限制性内切酶显色液液液美国公司鸡抗人美国公司辣根酶标记山羊抗鸡/美国公司正常非免疫动物血清羊福州迈新生物技术开发公司显色液福州迈新生物技术开发公司浙江大学硕士研究生毕业论文上海生工公司,进口分装上海生工公司进口分装矾一华美生物工程公司美国公司膜脱脂奶粉上海光明乳业集团美国垠公司显色液液液美国公司二、引物、质粒、大肠杆菌、人肾癌及癌旁组织样本、人肾癌及癌旁组织由浙江大学肿瘤研究所提供。、上下游引物序列如下上游引物,对应位点第一个外显子上下游引物,对应位点第三个外显子上、引物由上海生物工程工程公司提供、大肠杆菌、原核表达载体,翁”柏鹌蛸舵棚弼”船蕃他钔原核表达载体的物理图谱及多克隆位点塑垩查兰堡主婴塞生竺些堡苎由浙二医院病理科提供。、肾癌组织和癌旁组织的石蜡切片美国公司、鸡抗人美国公司、辣根酶标记山羊抗鸡,三、主要仪器法国公司、微量移液器,瑞典公司、紫外分光光度计盯、热循环仪低温高速离心机、,电子天平公司、凝胶数字成像系统美国、雪花状制冰机、一深低温冰箱、层析柜美国公司、纯水器、型自动测序仪娟公司、细菌恒温摇床美国衄、型恒温磁力搅拌器杭州仪表厂、电热恒温水浴箱上海医疗器械五厂四、实验中常用试剂的制备、凝胶电泳用液,加水定容至调至,、,加水定容至上样缓冲液甲醛,甲酰胺,“,溴酚兰少许,甘油,水,微波助甲醛变性胶琼脂糖,热,至,加入甲醛,混匀,立即铺胶、凝胶电泳用液电泳缓冲液,冰乙酸,浙江大学硕士研究生毕业论文,调至,双蒸水定容至、上样缓冲液甘油加少许溴酚兰、,无水,无水,用双蒸水溶解,高压灭菌、水加入三蒸水中,振荡过夜,高压灭菌。、细菌培养用液液体培养基蛋白胨,酵母提取液,加至,用玻璃管分装,高压灭菌。固体培养基在配制好的液体培养基中,按每升加入琼脂糖,高压灭菌,冷却至时,加入终浓度为的氨苄青霉素。铺平板、感受态细菌制备用液,溶液,甘油。高压灭菌,保存。溶液,甘油。高压灭菌,保存。、质粒提取用液/,/,新鲜配制/乙酸钾,冰乙酸,双蒸水、免疫组化常用液碱,盐酸调至,加蒸馏水定容至瑚,加,加水定容至、用液蛋白提取液,甘油,双蒸水定容至。碱,一甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸,待溶解后,双蒸水定容至。转膜缓冲液碱,甘氨酸,甲醇,定容至。碱,调至,加水定容至。浙江大学硕士研究生毕业论文方法组织总提取取样本组织研钵中研磨,加提取液,反复吹打约转移至管,加入倍体积的氯仿,用力振荡混匀,室温放置分钟后,条件下离心分钟,吸上清至另一管中,加入等体积的异丙醇,混匀后室温放置分钟,条件下离心分钟,弃上清,沉淀加乙醇,离心分钟洗涤次,室温放置分钟左右,加入适量水溶解,一保存备用。分光光度仪检测及定量测定,比值大于,说明没有蛋白质残余。定量浓度/稀释倍数甲醛变性凝胶电泳检测配置甲醛变性胶,取样品与上样缓冲液混匀,水浴变性,在电泳缓冲液中电泳电压,紫外成像仪下观察,可见,三条带,说明所提取的质量较好。第一链合成总反应体积为取,加水补充体积至,加入的,变性,立即置冰上,离心。然后加入以下试剂压矿“水浴分钟,然后水浴,一保存产物,备用反应体系斯江丈学预士研究生毕业论文上游弓物下游弓物。/“反应总体积为,上下游引物理论扩增片段为扩增条件,个循环结束后,延伸珊。产物回收采用公司的产物回收姑脯,水紫外光下将电泳产物切胶回收,加入倍体积的浴约,待琼脂糖凝胶完全溶解后加入层析柱中,静置玎后离心,弃废液,然后加入过柱,离心,弃废液,然后加入,静置,离心,弃废液后,再离心】,将层析柱另置一新虢进行的洗脱,静置管中,并在柱子中加入后,离心,收集洗脱液供克隆使用。克隆船总反应体积,连接过夜感受态细菌的制备挑取单个菌落接种于肉汤培养基中,振摇培养过夜,吸取加入到含新鲜肉汤培养基的三角烧瓶中,继续振荡培养小时,在条件下,离心分钟,弃上清,加入轻轻摇匀,冰上放置分钟,条件下,离心分钟,弃上清,加入,冰上放置分钟后,分装,每管,保存备用。新扛大学硕士磷究生毕业论文转化反应强一定体积的连接产物或者质粒,加入感受态细菌“,不中,冰浴分钟,在水浴中热休克秒,再冰浴分钟,加入的含任何抗生素的肉汤培养基,混匀,水浴小时,然后加入和,混匀后均匀涂布于平板含咖的/氨苄青霉素上,于孵箱中培养过夜。用消毒牙签挑取菌落,置于肉汤培养基含咖氨苄青霉素中,振摇培养过夜。质粒提取菌液于干净的试管中离心分钟,去上清,加入的液混匀,转移到消毒管中,离心分钟,尽量弃去上清置冰上,按照按分子克隆实验指南质粒提取方法。加入的,激烈振荡混匀,加入的,轻缓颠倒次,插入碎冰中分钟,加入的,轻缓颠倒次,插入碎冰中分钟,离心分钟,上清转入另一消毒的管中,加入倍体积的异丙醇,混匀,室温放置分钟,离心分钟,弃上清,沉淀的乙醇洗涤。待酒精挥发干后,加八的溶解,加入的储存液,混匀,水浴小时左右。加入等体积饱和酚颠倒分钟,离心分钟,上清加等体积的氯仿颠倒分钟,离心分钟,上清加/体积的“,倍体积的无水乙醇,混匀,插入冰中分钟,离心分钟,弃上清,沉淀的乙醇洗涤,待酒精挥发干后。一保存备用。酶切及测序鉴定己“体积为。水浴酶切,酶切产物经凝胶电泳验证无误后,再将克隆之质粒送测序证实。浙江大学硕士研究生毕业论文组织总蛋白提取将组织样本在研钵中研磨,每组织加组织蛋白提取液,冰上放置,将上清液转移至新的离心管。蛋白定量,的液体,对倍稀释法配制成、用配制,、等浓度的液体,各取上述各种浓度的于的管中,用公司的如,加入反应液,反应液,混匀,室温放置分钟,于测定其值同时各取上述提取的总蛋白悬液同样处理,以标准值计算出样本中蛋白质浓度。聚丙烯酰胺凝胶的配制安置好电泳板,配制分离胶、,两,、硌、混匀后马上灌胶,异丙醇封胶。配制浓缩胶、,、洳,、。、啪啪缸电泳取组织样本蛋白,加入蛋自质上样缓冲液,混匀后,煮沸分钟。加样于电流负极,恒压电泳,停止电泳。转膜电泳结束后剥胶,并将凝胶浸于适量的饪打中,平衡分钟。同时截取适当大小的膜和张滤纸,将膜预先在无水甲醇中浸湿,然后同滤纸一同浸于舵中,平衡分钟,安装凝胶和膜,在。、恒流条件下,于虢中进行转膜小时。封闭将转有蛋白的膜浸于脱脂奶粉配制中,。封闭过夜。杂交取出己封闭的膜,用漂洗分钟,共次。然后浸于稀释的浙江大学硕士研究生毕业论文一抗鸡抗人,脱脂奶粉,配制,中,摇床室温小时,漂洗分钟,共次。再浸于稀释的二抗脱脂奶粉,配制,叫辣根酶标记山羊抗鸡/,室温作用小时。压片取出膜,保鲜膜封膜,固定在暗盒内,曝光秒。由于组织总蛋白浓度定量受到多种因素干扰,所以需要重复上述步骤,调整蛋白上样量,使内参照含量接近一致,分析蛋臼含量。免疫组化,二甲苯石蜡切片于烤箱中烤片小时,经脱腊二甲苯,二甲苯工,梯度酒精脱水无水酒精,无水酒精,酒精,酒精,水洗次。浓缩液,加蒸馏水定容至,稀释倍。将脱腊后的切片于溶液中一煮沸。自然冷却约分钟。蒸馏水洗次,洗次。每张切片滴加“过氧化酶阻断溶液,室温孵育洗次,除去,每张切片滴加正常非免疫动物血清封闭,室温孵育除去血清,公司,每张滴加稀释的一抗鸡抗人美国置于保湿盒中室温孵育溉洗次除去,加公司,室稀释的二抗辣根酶标记山羊抗鸡/美国温孵育洗次除去,每张滴加显色液,一显微镜下观察。自来水冲洗,苏木素复染,梯度酒精脱水干燥,树脂封片。浙江大学硕士研究生毕业论文结果质量的鉴定采用提取组织样本的总对叮,其中可能存在少量,但由于我们的引物序列设计在两个不同的外显子上,中间相隔两个内含子序列,所以未经消化处理,不影响结果分析。分光光度仪检测其/,比值大于,甲醛变性胶电泳,条带清晰可见,且约为,表明提取的完整,没有降解图培提取总斟质量鉴定和克隆组织样本提取的经方法检测其中删拊的表达,结果显示人肾癌组织和癌旁组织都有完整的的表达,且相同反应条件下,癌组织砌州表达高于癌旁组织为内参照,产物大小为图。碴产物谚产物回收肾癌组织样本中基因的髓产物,与载体进行连接后经限制性内切酶酶切,得到一大小约为的片段,表渐江大学硕士研究生毕业论文明克隆成功。进一步测定的序列,并与的同源。的序列进行比对,结果与克隆的酶切鉴定培。、明”直相反,它的特异高表达提示它在肾癌细胞的病理演变过程中扮演着一个角色。为了进一步探讨在肾癌的发病和发生中的意义,本课题首先对肾癌组织基因的结构进行了研究,目的是研究肾癌组织中的分子和正常肝脏组织中有何不同,特别是是否存在单个核苷酸多样性和刚。我们的结果发现,肾癌组织中不同的剪切体的核苷酸序列和肝脏组织中的完全一样,我们也没有发现它存在有不同的剪切体。因此,对肾癌的研究可能主要要从对其新生物学功能的研究着手。为此,我们进一步进行了肾癌组织切片免疫组化的研究。有报道表明肝、脾、肾等代谢活动较旺盛的组织中内源性生物素含量较丰富外。为了避免由内源性生物素引起的假阳性结果,我们采用辣根过氧化酶标记的二抗。实验中石蜡切片为透明细胞癌。正常组织痛旁的免疫组化结果表明,在正常的肾组织中存在心蛋白的表达,但主要集中于肾小管内皮细胞,肾小球及其它结构中细胞表达量极低或不表达。而肾癌组织切片的免疫组化结果显示,癌组织已完全失去了正常的结构,绝大多数癌细胞均以较高水平表达,且部分细胞核出现阳性染色。我们试图从癌细胞的组织来源分析这一结果。随着分子生物学及遗传学研究的深入,结合肿瘤基因、染色体改变,近来肾癌分为透明细胞型,嗜色细胞型、嫌色细胞型、肾直管型及神经内分泌型。各型肾癌的组织学来源,细胞遗传变异进展见下表四。各型肾癌的组织学来源及细胞遗传学特征分型组织学来源细胞遗传学特征透明细胞型肾小管第三染色体缺失或第三染色体短臂异常浙江大学硕士研究生毕业论文首先,在癌旁组织中的肾小管上皮细胞中有一定水平的表达量,原因较易解释。肾小管尤其是近曲小管内皮细胞有着特定的生理功能,葡萄糖全部在近曲小管被重吸收,的重吸收,在近曲小管,水的重吸收,/在近曲小管,所以近曲小管的内皮细胞代谢活动非常旺盛,细胞内线粒体丰富。由于是类与代谢活动有关的酶,因此其在肾小管内皮细胞内含量较丰富容易理解。而在癌组织中,所有的癌细胞均以较高水平表达蛋白,这与肾小管起源的肾癌细胞中卜的表达量较高这一结果相符合,也从另一个方面证实了肾透明细胞癌的组织学来源。和免疫组化结果均显示卜蛋自在肾癌组织中有高表达现象,提示它在肾癌细胞的病理过程可能扮演着一个角色。由于肾癌发生发展的一个分子机理是第三位染色体短臂的抑癌基因高甲基化,但是我们基因芯片的结果发现甲基化酶在肾癌组织中表达十分低,因此我们推测可能与高甲基化有关。它在细胞核中是否有新的甲基化途径。所以需要进一步研究是否可以使胞苷酸甲基化。另外,它在胞浆中的高表达是否产生对肿瘤细胞有影响的产物,这些都需要进一步的研究。浙江丈学硼士研究生毕业论立参考文献廿,也,玎,、,酬舢时,封,缸,弛,出阳、曲,卸,李杰恩基因芯片技术在肿瘤研究中的应用中国医学文摘肿瘤学年第卷第期,血,】锄“叭一仰“,行昀彻,“记眦一】何志巍,谢鹭。许亮国,等一个与人鼻咽癌相关新基因的克隆。科学通报,岬,撕咖鲫锄蚴工【,】埘诅浙江大学硬士研究生毕业论文“,锄触墨,一啪,喊锄,仃,锄,曲,能谢锄,啪啪衙印血甜,龟锄协打,印,如,牖廿吐郑晖,蒋海鹰,颜亚晖,冯德云内源性生物素对免疫组织化学结果的影响湖南医科大学学报,胡志全章咏裳肾癌基础和临床结合的研究近况实用医学杂志年第卷第期浙江大学硕士研究生毕业论文针对的对结肠癌第二部分细胞作用的研究中文摘要是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,对细胞一周期的正常进行、中心体成熟、胞质分裂以及肿瘤的发生等方面均有重要影响,在大多数人类肿瘤中均表现为高表达。被认为可以作为癌症的血清标志物。为了研究在肿瘤细胞生长和分裂中的作用,我们利用技术在肿瘤细胞中敲除了的表达并观察了敲除后细胞生物学特征的改变。方法与结果化学合成了对应于碱基序列不同位点的三种特异,应用三种及其混合物、和,。,选择从到范围进行浓度梯度实验,经脂质体转染细胞,利用检测水平的变化发现,发现三种及对抑制作用具有明显的浓度效应,浓度的三种混合物转染小时后作用效果最好,水平降至最低,对细胞基因表达敲除超过。应用检测转染小时后基因敲除效率最高的三种混合物转染的细胞中蛋白表达水平的变化,发现蛋白水平明显降低,小时后染色检测作用对细胞数的影响,发现处理组活细胞的数量与的浓度成反比,尤其以。组的作用最为明显。当的浓度超过时,处理组细胞数仅为对照组的。电泳分析细胞凋亡发现处理组出现明显的梯带条形凋亡特征。结论、化学合成的特异刚细胞中的基因表达,并随之影响的蛋白水平。、通过敲除,可以有效抑制细胞存活,诱导细胞凋亡。,关键词实时定量,细胞凋亡塑垩盔堂堡主竺塑生望些堕圣一血/,一曲,】恐“虢廿仃色妣附町船腩啊惧,廿矗船眦埘瞻鼢噜、玲酽砒、印删廿,浙江大学硕士研究生毕业论文前言是种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶”,在人类基因图谱上定位于,年由瑞士实验肿瘤研究所的等最先报道。长,其的最大开放读框编码一种质量为道尔顿的蛋白质。进一步又发现,对细胞周期的正常进行、中心体成熟、胞质分裂以及肿瘤的发生等方面均有重要影响,成为近年来的研究热点之一。在大多数人类肿瘤中均表现为高表达,而且的过高表达在非小细胞性肺癌、头颈部肿瘤、食管癌、黑色素瘤患者均提示预后不良。在非小细胞性肺癌中中等量表达的患者比高表达的患者年生存率高。与其它增殖性标志或癌标志相比,对于预测肿瘤患者的预后和早期癌症诊断均有显著意义。有研究表明已经建立了针对的反义寡核苷酸,它能特异性地对刚及其蛋白产物表现为剂量依赖性的抑制作用,由此也抑制了的丝氨酸/苏氨酸激酶活性,能有效抑制培养细胞系或裸鼠肿瘤模型中肿瘤细胞的增殖。但是由于反义寡核苷酸的有效浓度较高,其潜在的毒副作用限制了它在临床上的应用【。随着技术的发展,我们试图用代替反义寡核苷酸,来抑制的表达,同样达到抑制细胞增殖,和诱导凋亡的目的。本课题研究观察了针对的对细胞后细胞水平和蛋白质水平的改变以及细胞凋亡的变化,为进一步探讨将技术用于肿瘤的治疗打下一个基础。浙江大学硕士研究生毕业论文实验材料一、实验试剂新生小牛血清杭州四季青生物工程材料研究昕上海生工公司胰蛋白酶鲫公司试剂公司,于中带齐公司,公司公司,上海生物工程公司公司,探针和引物公司,探针和引物上海生工公司上海生工公司,进口分装。黜上海生工公司进口分装、华美生物工程公司膜美国公司脱脂奶粉上海光明乳业集团美国丑公司显色液液液美国公司氯仿杭州萧山化学试剂厂无水乙醇杭州萧山化学试剂厂饱和苯酚上海华美生物工程公司蛋白酶上海华美生物工程公司兔抗抗体公司公司辣根酶标记山羊抗兔浙江大学硕士研究生毕业论文二、材料浙江大学肿瘤研究所提供细胞株从一基因引物一矾粥淞一基因探针上海生工公司种双链攻击基因位点三、主要仪器法国公司、微量移液器,瑞典珊公司、紫外分光光度计、热循环仪低温高速离心机、丁/砌电子天平、凝胶数字成像系统公司、雪花状制冰机美国、一深低温冰箱、层析柜美国公司、纯水器、型恒温磁力搅拌器杭州仪表厂、电热恒温水浴箱上海医疗器械五厂、细胞培养箱上海、细胞培养超净台上海、相差倒置显微镜日本四、试验中常用试剂的制备、凝胶电泳用液,加水定容至同调至,。,加水定容至,上样缓冲液甲醛,甲酰胺“,溴酚兰少许,甘油,鲈浙江大学硕士研究生毕业论文,水,微波助甲醛变性胶琼脂糖,热,至,加入甲醛,混匀,立即铺胶、凝胶电泳用液电泳缓冲液,冰乙酸,调至,双蒸水定容至、上样缓冲液甘油加少许溴酚兰、,无水,无水,用双蒸水溶解,高压灭菌、水加入三蒸水中,振荡过夜,高压灭菌。、用液蛋白提取液,甘油,双蒸水定容至。碱,秭甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸,待溶解后,双蒸水定容至。转膜缓冲液碱,甘氨酸,甲醇,定容至。碱,调至,加水定容至。浙江大学硕士研究生毕业论文方法细胞培养大肠癌细胞常规培养于含的小牛血清经。水浴分钟灭活的培养液中,此完全培养基内含/的青、链霉素,在。、浓度及饱和湿度条件下进行培养,生长至对数期时备用。作用适量细胞接种于孔以及细胞培养板中使第二天能达到左右融合。转染当天用。转染不同浓度的种及其混合物到细胞中。参照说明,在管中将的培加入的砌,中,混匀室温放置分钟,分别将一定量的种及其混合物加入到至体积,再混合两种溶液,室温放置分钟弃尽细胞孔的培养基,加入含小牛血清及青、链霉素的,然后加入制备好的上述转染试剂,空白组仅用转染试剂,一式三份,混匀,置细胞培养箱中。用于检测的孔板细胞和试剂用量均为孔板的/。附种双链攻击基因位点定量检测水平总提取小时吸去孔板中的培养液,尽量洗干加,/,上下吹打数次,以保证细胞破碎,室温分钟转移至管中,并加入氯仿,振荡秒,然后室温置分钟离心分钟取上清的三分之二转移到另一离心管中,加等量异丙醇,混匀,室温静置分钟离心分钟弃上清,加水配置的酒精,颠倒混匀,离心分钟弃上清,倒置待酒精挥发加水,放置分钟左右溶解电泳配制甲醛变性凝胶,取样品与上样缓冲液混匀,水浴变性分钟,在电泳缓冲液中,电压伏电泳小时,紫外成像仪下观察。浙江大学硕士研究生毕业论文紫外分光光度计测的浓度。样本,测光密度水调零,作为空白对照然后加浓度值稀释倍数/逆转录、水、水浴加水,于一保存。实时定量荧光定量检测基因表达水平,同管扩增内参照。弓物序歹一蛆一一探针序列、引物序列一一探针序冽一变性分钟变性秒退火分钟,扩增个循环。数据处理在的指数期内,根据仪器使用指南设定恰当的参数值和浙江大学硕士研究生毕业论文,得到每个反应的。值,值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。每个样本一式三份取平均值,以内参照基因相对定量基因表达转换公式如下。统计方法将使用和二项分布检验转换公式乩表示基因的量,表示基因的量,以及表示经扩增到一定量时的循环数。蛋白提取小时后提取转染的口三种混合物细胞蛋白,经胰蛋白酶消化,转移至印管中,离心收集细胞,生理盐水洗两次,每孔收集的细胞加蛋白抽提液,混匀,冰上放置,。上清转移至新的管中。细胞总蛋白浓度测定用配制的液体,对倍稀释法配制成、等浓度的液体,各取上述各种浓度的于的管中,用公司的,加入反应液,反应液,混匀,室温放置分钟,于测定其值同时各取上述提取的细胞的总蛋白悬液同样处理,以标准值计算出样本中蛋白质浓度。聚丙烯酰胺凝胶的配制配制分离胶、,“、锄、舭吼、配制浓缩胶、锄,、样品的准备及电泳取细胞样本蛋自,加入蛋白质上样缓冲液,混匀后,煮沸分钟。浙江大学碗士研究生毕业论文和预染加样于电流负极,恒压电泳约。转膜剪取适当大小的膜。用甲醛浸透后,在锄舵中平衡,再剪张滤纸大小同膜,用帆肫中平衡。牖浸湿备用。电泳结束后,揭下凝胶,并将其浸入在,恒流下进行转膜。封闭将转有蛋白的膜浸于脱脂奶粉配制中,。封闭过夜。杂交取出已封闭的膜,用漂洗分钟,共次。然后分别浸于稀释的一抗脱脂奶粉,稀释的抗中,摇床室温小时,漂洗分钟,共次。再浸于稀释的二抗辣根酶标记的脱脂奶粉,稀释的血二抗中,室温作用小时羊抗兔压片取出膜,保鲜膜封膜,固定在暗盒内,曝光秒,在光片上作好标记。检测小时后,在孔细胞培养板中,加入咖的,培养箱中孵,振荡左右,育,离心,弃去培养基,加入用酶标仪检测处吸光度,以空白组作为参照,其细胞数为,计算其余各组细胞数减少的百分数空白组吸光度一处理组吸光度电泳分析孔板培养的细胞洗涤,弃上清,细胞悬浮于中,加入至终浓度,混匀,加入蛋白酶至终浓度/,水浴,然后加入至终浓度/,水浴,然后等体积饱和苯酚氯仿异戊醇抽提,离心,上清加入上样缓冲液,混匀,水浴,立即插入冰中,后于琼脂糖凝胶电泳。浙旺尢学砸士研究生毕业论立结果对细胞中基因表达的作用我们选择了浓度从到以及种的混合物。总浓度与上述浓度相等,每种刚在其中占的比塞各为/。结果发现三种