课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、尿素分子的立体结构尿素分子的立体结构（一）筛选菌株（一）筛选菌株水生耐热细菌水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus )耐高温的耐高温的Taq DNA聚合酶聚合酶美国微生物学科布鲁克美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌年发现耐热细菌1、实验室微生物的筛选原理（、实验室微生物的筛选原理（P21） 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、括营养、温度、pHpH等），同时抑制或阻止其他等），同时抑制或阻止其他微生物生长。微生物生长。（一）筛选菌株（一）筛选菌株2 2、选择培养基、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生在微生

2、物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做长的培养基，称做选择培养基。选择培养基。（一）筛选菌株（一）筛选菌株 加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基 细菌不生长，细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长酵母菌、霉菌等真菌能生长 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基 分离分离自养型微生物自养型微生物 1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析该配方的培养基对微

3、生物是否具有选择作分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？用？如果有，又是如何进行选择的？有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。阅读阅读22页本课题使用的培养基配方页本课题使用的培养基配方（二）微生物计数（二）微生物计数1 1、显微镜直接计数法、显微镜直接计数法1mm每一个大方格边长为每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为盖上盖玻片后，载玻片与盖玻

4、片之间的高度为0.1mm，所，所以计数室的容积为以计数室的容积为0.1mm3。1mm下面以一个大方格有下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B，那么，一个，那么，一个大方格中的总菌数是多少大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）5AB1045A缺点：缺点：不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌2、统计菌落数目统计菌落数目稀释涂布平板法稀释涂布平板法（二）微生物计数（二）微生物计数平板菌落数统计注意事项1、几个菌落粘连一起

5、，只要肉眼能区分，就算几个；、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。某班级菌落数统计表格某班级菌落数统计表格第第1组组第第2组组第第3组组第第4组组151216519095256820717716235721781881024平均平均每每mL样品样品中活菌数中活菌数平板平板组别组别恰当的稀释度、正确的涂布操作恰当的稀释度、正确的涂布操作是是成功地统计菌落数目的关键。成功地统计菌落数目的关键。（取样（取样0.1mL,稀释倍数

6、稀释倍数106）思考思考1 1：如何根据平板上的菌落数推测：如何根据平板上的菌落数推测出每出每mLmL样品中的菌株数？样品中的菌株数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，计算出平统计某一稀释度下平板上的菌落数，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按公式板上的菌落数的平均值，然后按公式每每mL样品中样品中的菌株数的菌株数=（CV）M进行计算。进行计算。思考思考2 2：统计的菌落数往往比活菌的：统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低，为什么？实际数目高还是低，为什么？ 低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，上观察到的只是一个菌落

7、。因此，统计结果一般用统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示菌落数而不是活菌数来表示。思考思考3 3：为了增强实验结果的说服力和准确性，：为了增强实验结果的说服力和准确性，我们在实验设计时应该怎么做更合理？我们在实验设计时应该怎么做更合理？ 实例分析实例分析1 1 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中三个平板，但是其中1个平板的计数结果与另外个平板的计数结果与另外2个个相差太远，说明在操作过程中可能出

8、现了错误，因相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。想一想：哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两想一想：哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？（三）实验基本原则（三）实验基本原则1、平行重复原则、平行重复原则实例分析实例分析2 2想一想：想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，请分析原因可能有哪些？如此之大，请分析原因可能有哪些？实例分析实例分析2 2想一想：你能通过设置

9、对照，帮助想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？上述两个可能影响实验结果的因素吗？一种方案：一种方案： 可以由其他同学用与可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。同学一样的土样进行实验。如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。实例分析实例分析想一想：你能通过设置对照，帮助想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？上述两个可能影响实验结果的因素吗？另一种方案：另

10、一种方案： 将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 实验结果要有说服力，对照的设置实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的！是必不可少的！ 实例启示实例启示设置对照实验的目的是什么？ 排除实验操作、培养条件等无关变量对实验排除实验操作、培养条件等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）实验基本原则（三）实验基本原则1、平行重复原则、平行重复原则2、对照原则、对照原则3、单一变量原则、单一变量原则实验名称：实验名

11、称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验原理：实验原理：实验目的：实验目的：材料用具：材料用具：方法步骤：方法步骤：1、分组编号、分组编号 2、处理（遵循实验设计的基本原则）、处理（遵循实验设计的基本原则） 对照原则、单一变量原则（等量原则）对照原则、单一变量原则（等量原则） 科学性原则、平行重复原则科学性原则、平行重复原则 可行性原则可行性原则 3、观察记录（设计观察记录表）、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验预期：实验结果的分析与评价：实验结果的分析与评价：实验结论：实验结论：设计时请利用设计时请利用P23-P24的三个资料的三个资料（对照原则、单一变

12、量原则、平行（对照原则、单一变量原则、平行重复原则）重复原则）资料资料一一. .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。资料二资料二. .样品的稀释样品的稀释 将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得进行培养，以保证获得菌落数在菌落数在30-30030-300之间，之间，适于计数的平板。适于计数的平板。 分离不同的微生物能采用相同的稀释度吗？分离不同的微生物能采用相同的稀释度吗？测定土壤

13、中细菌的总量和测定土壤中能分解尿测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 答：不能。这是因为土壤中各类微生物的数量答：不能。这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧好氧及兼性厌氧细菌及兼性厌氧细菌数约为数约为2 1852 185万，万，放线菌数放线菌数约为约为477477万，万，霉菌数霉菌数约为约为23.123.1万。因此，为获得不同类万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时

14、还应当有针对性地提供选择培养的条件。时还应当有针对性地提供选择培养的条件。资料二资料二. .样品的稀释样品的稀释 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为10103 310107 7。 将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得进行培养，以保证获得菌落数在菌落数在30-30030-300之间，之间，适于计数的平板。适于计数的平板。 将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30 30 温度下培养。随着温度下培养。随着培养时间的延

15、长，会有不同的菌落产生。培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 以表格的形式记录选择培养基中不同菌落的特征。以表格的形式记录选择培养基中不同菌落的特征。 资料三资料三. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。需要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。焰旁操作。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品

16、的注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。稀释度等。 1 1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。及选择培养基是否筛选出一些菌落。2 2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在3030300300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？平板的菌落数相近？3 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？如果差异很大，可能是什么原因引起的？方法：在以尿素为唯一氮源的培养基方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果如果pHpH升高，指示剂将变红。升高，指示剂将变红。滤膜法滤膜法 以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美