Chapter7定量与系统适应性1

1、2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 2目录目录 准度与精度 外标法定量 内标法定量 标准加入法定量 括号式程序 系统适应性2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 3用用HPLC定量定量重现性好的定量重现性好的色谱方法重现性好的样品制备2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 4 误差 E = O - T O 观测到的值 T 真值液相色谱定量的

2、准确度液相色谱定量的准确度2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 5 色谱方法是相对定量方法,如不考虑损失及杂质干扰等因素,其结果同“标样”的准确程度密切相关 相关系数 其中X及Y分别代表不同方法的实验值及平均值测定结果的准度测定结果的准度 22)()()(YYXXYYXXriiii2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 6液相色谱定量的精密度液相色谱定量的精密度好的精度不好的精度 测量的精密度2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL

3、7精密度的衡量精密度的衡量)100(%12)(XX CVNXiXNiX变异系数变异系数标准偏差标准偏差平均值平均值 测量精密度的计算2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 8分析测试结果分析测试结果2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 9基线修正基线修正2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 10线性检测器响应线性检测器响应2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 11 配置一系列

4、已知浓度的标准样储备标样储备标样外标法校正曲线标样的配制外标法校正曲线标样的配制2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 1205010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()标准曲线标准曲线0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00

5、 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s外标法校正曲线外标法校正曲线外标法校正曲线

6、外标法校正曲线2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 13iXiiiXARFCXRXCRFii样样品品响响应应值值未未知知组组分分的的浓浓度度标标样样响响应应值值标标样样浓浓度度校校正正因因子子 )()()()( 计算公式 特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确结果的计算结果的计算2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 14 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样储备标样储备内标样工作溶液内标法校正曲线溶液的配制内标法校正曲线溶液的配制2009 Wat

7、ers Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 150.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样品浓度样品浓度标样峰面积标样峰面积内标样峰面积内标样峰面积标准曲线标准曲线内标法校正曲线内标法校正曲线2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDEN

8、TIAL 16结果计算结果计算 计算公式 特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标物结果与进样体积无关.)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii内内标标峰峰面面积积样样品品峰峰面面积积未未知知组组分分的的浓浓度度标标样样浓浓度度标标样样响响应应值值内内标标样样响响应应值值校校正正因因子子 2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 17 对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其它色谱峰分离好内

9、标物的选择内标物的选择2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 18标准加入法标准加入法+内标法定量内标法定量2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 19括号式程序括号式程序全部平均全部平均平均平均2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 20更多的括号式程序更多的括号式程序不平均不平均不平均不平均不平均不平均平均平均2平均平均1平均平均1平均平均22009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIA

10、L 21最低浓度标样最高浓度标样所希望的检测范围线性问题灵敏度问题检测器响应样品浓度 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误定义可接受的范围限度定义可接受的范围限度2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 22吸收值与浓度吸收值与浓度浓度理想的实际的背景吸收吸收值210102009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 23系统适应性测试系统适应性测试2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 24什么是系统适

11、应性测试什么是系统适应性测试 HPLC 数据的精度与准度来自于一个性能良好的色谱系统。 系统适应性试验意味着检查整个系统是在可接受的限度内工作的。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 25系统适应性试验的基础系统适应性试验的基础 仪器、电子的、分析上的操作，以及样品组成了一个完整的系统，可以作为一个整体进行评估。系统适应性试验即是建立在这一概念上的。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 26系统适应性指南（系统适应性指南（USP，EP以及以及JP） United States Pha

12、rmacopeia / National Formulary美国药典美国药典/国家处方集（简称USP/NF）。最新版为USP31-NF26。 European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) ，现已经出版到EP6.5。 日本药局方日本药局方（The Japanese Pharmacopoeia）由日本药局方日本药局方编集委员会编篡，由厚生省颁布执行。日本药典日本药典最新版是2001年出版的第十四改正版。 2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 27系统适应性参数系统适应性参数 容量因子，k=（tr-t0）/t0 重现性 相

13、对保留， =k2/k1 分离度，Rs=(tr2-tr1)/(1/2)(w2+W1) 拖尾因子，T=Wx/2f 理论塔板数，N=16(tr/w)22009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 28系统适应性参数与建议值系统适应性参数与建议值参数参数推荐值推荐值容量因子（k）目标峰应当与其他峰以及死体积很好地分开。通常k2.0重复性理想的RSD1.0（n5） 相对保留如果保留时间是稳定的则不是必须的分离度（Rs）目标峰与相邻的干扰物质洗脱峰（杂质、辅料、降解产物或内标物）之间的Rs应该2或者=2.拖尾因子（T）T2理论塔板数（N）通常理论塔板数应当2

14、0002009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 29何时进行系统适应性试验何时进行系统适应性试验 当需要确保结果的重现性以及色谱系统的性能指标时，进行系统适应性试验 在分析未知物之前或之后 在色谱条件改变之后 协助验证系统（整体验证） 系统的故障排除2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 30系统适应性系统适应性 分离 为了确保系统在指标内，记录分离标准的趋势，例如分离度，拖尾因子，理论塔板数 重现性 标样分析的总结，确保系统在特定的重现性指标内工作2009 Waters Corporat

15、ion | COMPANY CONFIDENTIAL 31系统适应性系统适应性 系统适应性样品 主要物质以及副产物的混合物，用于测定系统适应性。 标准物质 已知浓度的样品 控制样 已知浓度的样品，被当做未知物进行测定，用于计算测定结果与实际值之间的偏差2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 32系统适应性系统适应性 系统适应性样品应该至少在一系列的样品测定前后运行 控制样应该贯穿整个样品序列，按照一定的间隔运行2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 33自动系统适应性自动系统适应性 如果

16、使用一个含有以下内容的报告方法报告结果： RSD 棒图 需要监测的参数的综合统计表 使用RSD棒状图和综合统计表监测系统性能后，可以使您对系统精度和准度的可接受程度，以及系统是适用于运行未知样的这些内容非常有信心2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 34限制限制 设置时需小心 不要比仪器的指标设置得更窄 误差下限（Lower error limit, LCL） 误差上限（Upper error limit, UCL） 目标值 警告下限（Lower warning limit） 警告上限（Upper warning limit） 综合图中的

17、限制可以标记出不能接受的值2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 35系统适应性报告系统适应性报告12009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 36系统适应性报告系统适应性报告22009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 37利用系统适用性检查系统重复性利用系统适用性检查系统重复性2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 38重现性重现性全局RSD棒状图2009 Waters Corpora

18、tion | COMPANY CONFIDENTIAL 39使用系统适应性对色谱系统进行故障排除使用系统适应性对色谱系统进行故障排除 系统适应性软件允许通过查看峰的信息对系统进行故障排除： 保留时间 分离度（Rs），美国药典分离度 容量因子（k） 分离因子（选择性，） 柱效（理论塔板数，N） 拖尾或对称因子 基线噪音与漂移2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 40使用系统适应性对色谱系统进行故障排除使用系统适应性对色谱系统进行故障排除溶剂瓶泵进样器检测器保留时间拖尾RSD%面积理论塔板数噪音与漂移线性分离度2009 Waters Corporatio