脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测

1、脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测【关键词】脆弱类杆菌；荧光定量PR；SYBR,Green,I摘要：目的讨论荧光定量PR技术检测脆弱类杆菌。方法用特异性引物和荧光染料实时PR扩增并检测产物。结果脆弱类杆菌标准株(AT25285)和4株别离株均有特异扩增曲线，灵敏度达102个菌；而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论荧光染料实时PR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌关键词：脆弱类杆菌；荧光定量PR；SYBRGreenIDetetinbateriafragilebySYBRGreenreal-tiePRAbstrat：bjetiveTidentifythebateriafragile

2、s(B.fragiles)by16StargetrRNArealtiePR.ethdsApairfspeifipriersasdesigned.ThePRprdutseredetetedbyfluresentquantifiativerealtiePR.ResultsTheB.fragilisAT25285and4separativestrainsfB.fragilisappearedinthespeialaplifiatinprduturve,hileE.li,L.bulgariusandS.therphilusdidnt.ThefluresentqantifiativePRandetet1

3、02bateria.nlusin16SrRNAtargetedprierandfluresentquantifiverealtiePRanbeappliablefrtheidentifiatinandquantifiatinfB.fragilis.Keyrds：bateriafragile;fluresentquatititivePR;SYBRGreenI脆弱类杆菌是G-性无芽孢厌氧菌中最常见临床别离株，常规厌氧培养别离需27d，不能及时指导临床区分病原菌。细菌分子生物学技术的开展为检测细菌感染提供了早期特异敏感的检测方法1。本文采用荧光定量PR检测脆弱类杆菌的16SrRNA基因。结果报告如下

4、。1材料与方法11材料111菌株与培养脆弱类杆菌AT25285复旦大学医学院；脆弱类杆菌临床别离株4株，选用拟杆菌Bd培养基厌氧培养鉴定；保加利亚乳杆菌I6047、嗜热链球菌I6038、大肠埃希菌AT25922各1株，选用双歧杆菌BL培养基培养。112仪器与试剂定量PR扩增仪及配套分析软件GeneAp5700,美国Perkin-Eler公司，离心机；细菌基因组提取试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、10缓冲液、SYBRPreixExTaqTperfetReal-tie荧光染料TakaRa宝生物工程大连。12方法121引物设计在16SrRNA序列中第831-864位点和982-1007位点，通过分析

5、软件Blast(nbinlnihgv)同GenBank中大肠埃希菌等基因序列相比拟，参照文献2设计特异性引物。正向引物：F:5-gaaagattaagtattatg-3；反向引物：R:5-ggtgattggtatgaa-3，由TakaRa宝生物工程大连合成。122特异性测定分别取不同试验菌增菌培养液，按提取试剂盒说明书进展细菌基因提取，使每1l提取液中含有106个细菌的DNA，进展荧光定量PR。123灵敏度测定将标准株菌液计数为109/l，倍比稀释使每1l提取液中含有107,106,105,104,103,102,10,1个细菌的DNA，进展荧光定量PR。扩增产物的融解曲线用配套分析软件中的D

6、issiatinPrtl程序制图和分析。124SYBRGreen嵌和荧光染料实时PR反响体系及条件10Buffer含SYBRGreen染料g2+dNTPTaq酶5l；正反向引物各02l10l；待检样品1l，加水34l混匀后，按9510s，955s，6034s，共进展40个循环。2结果21特异性PR结果显示，5株脆弱类杆菌均有特异扩增曲线，而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。22灵敏度图1图1可见，荧光信号强度Rn维持在基线0对应的横线上，15个循环后，Rn开场上升。107，106，105的扩增曲线在30个循环后到平台期，104,103,102的扩增曲线在3840个循环时到平

7、台期。灵敏度达102个菌。自左向右的扩增曲线为：107,106,105,104,103,102,101l图1不同菌数的脆弱类杆菌标准株荧光定量PR扩增图略23融解曲线图2图2可见，主峰为特异的扩增产物，从10510细菌含量的主峰峰值逐个降低，但位置一致；主峰前的小峰79处,可能是很少量的引物二聚体形成而致,并随细菌含量模板量降低，主峰与小峰的峰值差减校自上向下的峰线为105,104,103,102,101l图2扩增产物的融解曲线略3讨论本文结果显示，前引物序列831864在脆弱类杆菌中完全互补，而与大肠埃希菌等互补序列不多；序列9821007为脆弱类杆菌特有序列，其他细菌没有与之相对应的序列。

8、荧光定量PR说明，5株脆弱类杆菌有扩增产物，采用一样引物用rPR扩增，在预计区域有扩增条带3，2种方法结果一致，可与大肠埃希菌、乳酸杆菌、嗜热链球相鉴别。本文受检菌菌数可低至102，与其他文献根本一致4。16SrRNA荧光定量PR检测脆弱类杆菌，具有快速、敏感的特点，但在降低费用、商品化程度等方面应加以改良。参考文献1苏维奇，纪迎春，姜岩.16SrRNA基因检测在临床细菌学鉴定中的应用J.世界感染杂志，2022，51：79-80，83.2Erjaalinen,AnnaKassinen,TeeuRinttil，etal.parisnfreal-tiePRithSYBRGreenIr5-nuleaseassaysanddt-blthybridizatinithrDNA-targetedlignuletideprbesinquantifiatinfseletedfaealbateriaJ.