环境生物监测与安全性评价课件

第一节环境监测一、概念环境监测的过程一般为：现场调查监测计划设计优化布点样品采集运送保存分析测试数据处理综合评价第一节环境监测一、概念1二、环境监测的目的和分类（一）环境监测的目的环境监测的目的是准确、及时、全面地反映环境质量现状及发展趋势，为环境管理、污染源控制、环境规划等提供科学依据。二、环境监测的目的和分类（一）环境监测的目的2（二）环境监测的分类1.按监测目的分类（1）监视性监测（又称为例行监测或常规监测）对指定的有关项目进行定期的、长时间的监测，以确定环境质量及污染源状况、评价控制措施的效果，衡量环境标准实施情况和环境保护工作的进展。包括对污染源的监督监测和环境质量监测。（二）环境监测的分类1.按监测目的分类3（2）特定目的监测（又称为特例监测和应急监测）根据特定的目的可分为以下四种：A污染事故监测B仲裁监测C考核验证监测D咨询服务监测（2）特定目的监测（又称为特例监测和应急监测）4（3）研究性监测（又称科研监测）

研究性监测是针对特定目的科学研究而进行的高层次的监测。例如环境本底底监测及研究；有毒有害物质对从业人员底影响研究；为监测工作本身服务的科研工作的监测，如统一方法、标准分析方法的研究、标准物质的研制等。这类研究往往要求多学科合作进行。（3）研究性监测（又称科研监测）52.按监测介质对象分类可分为水质监测、空气监测、土壤监测、固体废物监测、生物监测、噪声和振动监测、电磁辐射监测、放射性监测、热监测、光监测、卫生（病源体、病毒、寄生虫等）监测等。2.按监测介质对象分类可分为水质监测、空气监测、土壤6三、环境监测特点（一）环境监测的发展污染监测阶段或被动监测阶段环境监测阶段或主动监测阶段污染防治监测阶段或自动监测阶段三、环境监测特点（一）环境监测的发展7（二）环境监测的特点1.环境监测的综合性环境监测的综合主要表现在监测手段、监测对象的多样性以及监测数据处理的复杂性。2.环境监测的连续性3.环境监测的追踪性（二）环境监测的特点1.环境监测的综合性8四、监测技术概述监测技术包括采样技术、测试技术和数据处理技术，这里以污染物的测试技术为重点作以概述。（一）化学、物理技术重量法常用作残渣、降尘、硫酸盐、油类等的测定；容量分析被广泛用于水中酸度、碱度、化学需氧量、溶解氧、硫化物、氰化物的测定；

仪器分析方法被广泛用于对环境中污染物进行定性和定量的测定。四、监测技术概述监测技术包括采样技术、测试技术和数据9（二）生物技术

这是利用生物在污染环境中所产生的各种反映信息来判断环境质量的方法，是一种最直接也是一种综合的方法。生物监测包括生物体内污染物含量的测定；观察生物在环境中受伤害症状；生物的生理生化反应；生物群落结构和种类变化等手段来判断环境质量。（二）生物技术10第二节生物传感器一、概述传统的环境监测方法通常采用离线分析方法，其缺点是：分析速度慢，操作复杂，且需要昂贵仪器，不适宜进行现场快速监测和连续在线分析。建立和发展连续、在线、快速的现场监测体系尤其重要。

生物传感器实际上是一类特殊的化学传感器。国际纯粹和应用化学联合会对化学传感器的定义为：一种小型化的、能专一和可逆地对某种化合物或某种离子具有应答反应，并能产生一个与此化合物或此离子浓度成比例地分析信号的传感器。第二节生物传感器一、概述生物传感器实11生物传感器是一种将生物感应元件的专一性与一个能够产生与待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的一种分析装置。最先问世的生物传感器是酶电极。20世纪70年代后，人们开始研究微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。生物传感器是一种将生物感应元件的专一性与一个能够产生12二、生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由敏感元件，即生物元件和信号传导器组成。生物元件：是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等。传导器：主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。二、生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由敏感元件，即生13生物传感器的基本原理如下图所示：生物传感器的基本原理如下图所示：14生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单元）和待测物质之间的相互作用，有以下几种类型：（1）将化学信号转化为电信号已研究的大部分生物传感器的工作原理均属于这种类型。（2）将热变化转化为电信号（3）将光效应转化为电信号（4）直接产生电信号方式生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单15三、生物传感器的分类一般可从以下三个角度进行分类：1.根据传感器输出信号的产生方式（1）生物亲和型生物传感器S+RSR底物受体（2）代谢型或催化型生物传感器S+RSRP底物受体生成物三、生物传感器的分类一般可从以下三个角度进行分类：162.根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、免疫传感器等。3.根据生物传感器的信号转化器可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等2.根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器17环境生物监测与安全性评价课件18四、生物传感器的特点1.根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛。2.测定时一般不需要样品预处理，也不需加入其他试剂。3.由于它的体积小，可以实现连续在线监测。4.响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。5.传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及。四、生物传感器的特点1.根据生物反应的特异性和多样性,理论上19酶传感器它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。例如,脲在尿素酶催化下发生反应1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。五、生物传感器在环境监测中的应用酶传感器五、生物传感器在环境监测中的应用20环境生物监测与安全性评价课件21葡萄糖电极缺点:(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时,响应电流明显下降而影响检测限;(3)传感器响应性能受溶液pH值和温度影响较大葡萄糖电极缺点:22环境生物监测与安全性评价课件232.微生物传感器微生物传感器分为两类：一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧,可以氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。装置是：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理是：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的.2.微生物传感器微生物传感器分为两类：24例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时,均消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因25环境生物监测与安全性评价课件263.BOD生物传感器利用生物传感器的原理，以微生物的单一菌种或混合种群作为BOD微生物电极，由于水体中BOD物质的加人或降解代谢的发生，导致水中的微生物内外源呼吸方式的变化或转化，藕联着电流强弱信号的改变，一定条件下传感器输出的电流值与BOD的浓度呈线性关系。用于制作BOD生物传感器的微生物主要有用单一菌种如丝孢酵母、梭菌、芽孢杆菌及混合微生物种群如活性污泥制成的BOD传感器，还有用生物发光菌和嗜热菌的。3.BOD生物传感器27基本组成：基本组成：28存在问题：由于微生物培养不稳定，使传感器不能保持良好、稳定的运行；一种微生物不可能对各种废水中所有的有机物都产生响应，因此，用单一菌种制备的BOD传感器只适用于部分类型的废水；微生物细胞在测定废水中有毒物质时由于缺乏抗性，会出现“中毒”现象；用常温微生物组成的BOD微生物电极的使用寿命不长。存在问题：294.免疫传感器抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能,在与抗原结合时,选择性强,灵敏度高，免疫传感器就是利用其双重功能将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变化,通过适当的传感器可检测这些参数,从而构成不同的免疫传感器，总的来说可分为两类:(1)非标记型;(2)标记型4.免疫传感器抗体对相应的抗原具有识别和结合30图10－6免疫传感器的原理如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成,加到待测样品中,酶标记的及未标记的黄曲霉毒素便会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应,测定酶标黄曲霉毒素与抗体的结合率,便可知样品中的含量。根据使用的信号转换器,有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器等。图10－6免疫传感器的原理如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄31免疫传感器在环境检测中的应用：检测农药：对于有机农药传感器检测不仅比色谱法检测更方便，而且检测精度也是分光光度法很难达到的。Li等制备出五氯酚(PCP)的两种抗原，获得PCP-BSA耦联物并免疫接种得到相应抗体，设计出一种快速经济的免疫检测法，能够在5mln之内检测出土壤样品中的PCP含量，检测限为1mg／L。还有除草剂草甘磷、谷连松等。检测有机物：Gauger等开发出一种可携带式的现场检测连续流动免疫传感器，预处理简单，能在5min之内测定土壤中的三硝基甲苯和环三亚甲基三硝胺，精确度可达到10μg／L。检测金属类物质：主要是重金属离子[cr(VI)，Pb(II)，Cu(II)，Cd(II)，Cr(III)，Hg(II)，Ag(II)，Co(II)，Sn(II)和Ni(II)等。Blake等将乙二胺四乙酸、二亚乙醛三胺五乙酸(DTPA)等与重金属离子Cd(II)，Co(II)，Pb(II)和U(VI)螯合后作半抗原制成单克隆抗体，利用竞争机制，制成免疫传感器荧光检测。检测微生物：Wong等开发出一种基于石英晶体微量天平(QCM)技术的免疫传感器检测沙门氏菌。在细胞数量线性范围105×108／ml内，该传感器检测沙门氏菌没有明显干扰，检测下限为104／ml。还可检测金黄色葡萄球菌和其他一些病毒和细菌。免疫传感器在环境检测中的应用：检测农药：对于有机农药传感器检32存在的问题：目前存在的问题在于，已得到的有害物质对应的抗体有限，固定后的抗体的稳定性也是免疫传感器发展的制约因素之一；传感器在测定后再生困难，需要重新固定分子识别膜等条件都给免疫传感器技术从实验室技术转化为商业化产品带来了困难。但是随着新的微型换能器的应用、具有良好稳定性的新抗体的开发及固定抗体的稳定剂的研制，免疫传感器在检测环境中痕量有害物质和堆肥化过程控制中的应用必将有更加广阔的前景。存在的问题：目前存在的问题在于，已得到的有害物质335.DNA生物传感器分子生物学与生物技术的进展为研究以核酸探针为敏感元件的DNA生物传感器提供了可能。与酶和抗体不同，核酸识别层十分稳定，并且易于合成或再生以供重复使用。

DNA生物传感器是将核酸作为分子识别及检测层并与各种物理的、化学的换能器相结合而产生的一种可以在物质分子水平上进行快速检测、监控的微量分析技术。DNA生物传感器在稳定性、可重复性、快速性、便捷性、灵敏度等方面所表现出的优越性，使得它成为当今生物分析测量领域的热点。

5.DNA生物传感器分子生物学与生物技术的进34（1）核酸杂交生物传感器的原理DNA生物传感器依据DNA分子之间或DNA分子与其它物质的相互作用(也称杂化作用)所引起的各种变化，来记录、分析发生在传感器和探测目标之间的杂化反应，以完成对目标物的探测和监控。（1）核酸杂交生物传感器的原理DNA生物传感器依35用非螺旋的肽骨架替代DNA分子中的磷酸骨架合成出肽核酸(PNA)，他们合成的PNA中，含有与胸腺嘧啶相连的氨基单位，保留了DNA分子的基本杂化特征，同样可以识别双株DNA链中的互补物。用非螺旋的肽骨架替代DNA分子中的磷酸骨架合成出肽核酸(P36（2）污染物的检测DNA传感器除可用于受感染微生物的核酸序列分析；

检测污染物和其它环境有害物质：Pandey等人将双链DNA固化在柱面波导的表面形成DNA生物传感器，并结合流式注射系统，以测量荧光信号的强度来检测可与双链DNA发生嵌入反应的化合物；检测DNA的物理损伤；可用于研究污染物与DNA之间的相互作用，为解释污染物毒性作用机理提供了可能。（2）污染物的检测DNA传感器除可用于受感染微生物的376.其他生物传感器6.1酚类微生物传感器

属于酶传感器。用酶电极安培传感器检测酚类化合物时，电极表面的酶分子被氧和过氧化氢氧化，接着被酚类化合物重新还原，酚类主要转化为苯醌或酚自由基，这些产物通常具有电化学活性，能在相对于饱和甘汞电极（SCE)0V以下的电位还原，还原电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。6.其他生物传感器属于酶传感器。用酶电极安培386.2阴离子表面活性剂传感器包括能降解烷基苯磺酸（LAS)的细菌和一个氧电极。当阴离子表面活性剂存在时，细菌的呼吸作用增加，导致溶解氧变化。6.3水体富营养化监测传感器引起水体富营养化的蓝细菌细胞体内有藻青素，它显示的荧光光谱不同于其他的微生物，从而用对荧光敏感的生物传感器就能监测蓝细菌的浓度。6.2阴离子表面活性剂传感器包括能降解烷基苯396.4生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮6.5检测有毒有害物质的生物传感器6.6空气和废气监测传感器（1）CO2传感器（2）亚硫酸盐传感器（3）甲烷传感器6.4生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮40第三节PCR技术PCR的概念PCR反应原理PCR反应体系和方法PCR反应特点PCR类型PCR技术在环境检测中的应用第三节PCR技术PCR的概念41一、PCR的概念PCR概念的提出：1983，KaryMullis定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。一、PCR的概念PCR概念的提出：1983，KaryMul42引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA43Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。thermusaquaticusMullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA44

此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在

1989

年，Science

将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子

(Molecule

of

the

year)此酶具有以下特点：45在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

二、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板46

体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物5’3’体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类47加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以48PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退49三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变50

总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶1反应体系总体积51PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程PCR技术的基本过程(1)模板DNA预变性模板DNATa52PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次PCR技术的基本过程(2)Taq酶循环仪94℃Taq酶753琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)541）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。1）PCR反应成分（1）模板3PCR反应条件（2）引物浓度55（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度；四种dNTP浓度应相等；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（4）dNTP（5）Mg2+562）循环参数变性

使双链DNA解链为单链，94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75℃,一般为72℃，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次，次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加2）循环参数（3）延伸57经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever经典循环参数（500bp以内）94℃3058四、PCR反应的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍四、PCR反应的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达23592）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决60引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。引物设计：613）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可62目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子631）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针五、PCR的类型1）不对称PCR五、PCR的类型64

高浓度引物低浓度引物高浓度引物低浓度引物652)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互66环境生物监测与安全性评价课件67电泳引物123412343）多重PCR（复合PCR）设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物123412343）多重PCR（复合PCR）684）标记PCR（LP-PCRLabelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒44）标记PCR（LP-PCRLabelledpri69标记引物ＰＣＲ观察PCR产物标记引物ＰＣＲ观察PCR产物705）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。5）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStill716）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链72六、PCR技术在环境检测中的应用①应用PCR技术研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态。②应用PCR技术监测环境中的特定微生物，如致病菌和工程菌。

从环境样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA；以从环境微生物中提取的DNA或RNA核酸作为模板，进行PCR扩增反应；PCR反应产物的检测与分析

六、PCR技术在环境检测中的应用①应用PCR技术研究特定环境73第四节DNA分子标记技术一、分子标记的概念

分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列。能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。第四节DNA分子标记技术一、分子标记的概念74二、分子标记的种类分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括：限制性片段长度多态性标记（RFLP标记）；DNA指纹技术；原位杂交等；第二类是以PCR技术为核心的分子标记技术，包括：随机扩增多态性DNA标记（RAPD标记）；简单序列重复标记（SSR标记）；扩增片段长度多态性标记（AFLP标记）等；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（SNP标记）；表达序列标签（EST标记）等。二、分子标记的种类分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分75三、分子标记技术在环境监测中的应用分析环境污染物的遗传毒性效应，为污染物早期诊断和评价提供依据；环境致病微生物的检测。利用RT－PCR技术检测禽流感病毒，SARS病毒等。三、分子标记技术在环境监测中的应用分析环境污染物的遗传毒性效76第五节分子生物学在环境微生物研究中的应用重组细菌用于环境污染防治分子生物学技术在环境微生物监测中的应用分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究中的应用第五节分子生物学在环境微生物研究中的应用重组细菌用于环境775.1重组细菌用于环境污染防治微生物降解胞内酶在细胞表面表达更好发挥生物降解功能5.1重组细菌用于环境污染防治微生物降解胞内酶在785.2分子生物学技术在环境微生物监测中的应用环境中存在的大量微生物中,仅有1%可通过传统的培养方法在培养皿上进行培养和进一步分离,而绝大多数细菌要求非常严格的营养条件或是难以培养。PCR技术及衍生出的一系列生物技术,使得在复杂环境中对那些混合物内低含量的群体成员或生物群中某个特异基因的检测与研究成为可能。5.2分子生物学技术在环境微生物监测中的应用环境中存在的795.3分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究中的应用对转基因生物的环境安全问题需进行长期的系统的研究,因风险的出现有长期滞后性。在关于被引入遗传物质的稳定性和新的遗传物质是否转移到其他微生物中,通过生物的表型可初步判断,进一步的证实则可以利用DNA序列分析,探针杂交等。5.3分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究80一、生物安全的概念狭义：生物安全是指防范由现代生物技术的开发和应用（主要指转基因技术）所产生的负面影响即对生物多样性、生态环境及人体健康可能构成的危险或潜在风险。广义:是国家安全问题的组成部分，是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康及生态环境所产生的危害或潜在风险。大致分为三个方面：

（1）是指人类的健康安全；（2）是指人类赖以生存的农业生物安全；（3）是指与人类生存有关的环境生物安全。第六节现代生物技术的安全性问题一、生物安全的概念狭义：生物安全是指防范由现代生物技术的开81人类关注的生物安全主要在以下几方面：天然的生物因子——主要包括动物、植物和微生物。其中由微生物特别是致病性微生物所导致的安全问题。转基因生物——主要包括转基因动物、转基因植物和转基因微生物。生物技术——人们在利用生物技术造福人类的同时，也可能带来意想不到的安全问题，特别是生物技术的滥用对人类健康、生态环境以及社会、经济都可能造成严重危害。

外来生物入侵人类关注的生物安全主要在以下几方面：天然的生物因子——主要包82二、转基因生物安全转基因生物,是指运用重组DNA技术将外源基因整合到受体生物基因组,所产生的具有全新特性的生物。转基因技术的应用前景是非常广阔的，以基因工程为代表的一大批生物技术成果，进入人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用。完善相应的法令法规，利用法制手段确保转基因生物的安全性。如我国1993年制定的《基因工程安全管理办法》和2002年颁布的《农业转基因生物标识管理办法》。转基因生物的安全评价二、转基因生物安全转基因生物,是指运用重组DNA技术将外83三、生物入侵及其控制物种从自然分布地区（可以是其他国家和中国的其他地区）通过有意或无意的人类活动而被引入，在当地的自然或人造生态系统中形成了自我再生能力，给当地的生态系统或景观造成了明显的损害或影响。这种现象称为“生物入侵”。农业部最新统计显示，目前入侵我国的外来生物已达400余种。近十年来，新入侵我国的外来入侵生物至少有20余种，平均每年递增１～２种。我国已经成为遭受外来入侵生物危害最严重的国家之一，面临的防治形势越来越严峻。三、生物入侵及其控制物种从自然分布地区（可以是其他国家和中国84第一节环境监测一、概念环境监测的过程一般为：现场调查监测计划设计优化布点样品采集运送保存分析测试数据处理综合评价第一节环境监测一、概念85二、环境监测的目的和分类（一）环境监测的目的环境监测的目的是准确、及时、全面地反映环境质量现状及发展趋势，为环境管理、污染源控制、环境规划等提供科学依据。二、环境监测的目的和分类（一）环境监测的目的86（二）环境监测的分类1.按监测目的分类（1）监视性监测（又称为例行监测或常规监测）对指定的有关项目进行定期的、长时间的监测，以确定环境质量及污染源状况、评价控制措施的效果，衡量环境标准实施情况和环境保护工作的进展。包括对污染源的监督监测和环境质量监测。（二）环境监测的分类1.按监测目的分类87（2）特定目的监测（又称为特例监测和应急监测）根据特定的目的可分为以下四种：A污染事故监测B仲裁监测C考核验证监测D咨询服务监测（2）特定目的监测（又称为特例监测和应急监测）88（3）研究性监测（又称科研监测）

研究性监测是针对特定目的科学研究而进行的高层次的监测。例如环境本底底监测及研究；有毒有害物质对从业人员底影响研究；为监测工作本身服务的科研工作的监测，如统一方法、标准分析方法的研究、标准物质的研制等。这类研究往往要求多学科合作进行。（3）研究性监测（又称科研监测）892.按监测介质对象分类可分为水质监测、空气监测、土壤监测、固体废物监测、生物监测、噪声和振动监测、电磁辐射监测、放射性监测、热监测、光监测、卫生（病源体、病毒、寄生虫等）监测等。2.按监测介质对象分类可分为水质监测、空气监测、土壤90三、环境监测特点（一）环境监测的发展污染监测阶段或被动监测阶段环境监测阶段或主动监测阶段污染防治监测阶段或自动监测阶段三、环境监测特点（一）环境监测的发展91（二）环境监测的特点1.环境监测的综合性环境监测的综合主要表现在监测手段、监测对象的多样性以及监测数据处理的复杂性。2.环境监测的连续性3.环境监测的追踪性（二）环境监测的特点1.环境监测的综合性92四、监测技术概述监测技术包括采样技术、测试技术和数据处理技术，这里以污染物的测试技术为重点作以概述。（一）化学、物理技术重量法常用作残渣、降尘、硫酸盐、油类等的测定；容量分析被广泛用于水中酸度、碱度、化学需氧量、溶解氧、硫化物、氰化物的测定；

仪器分析方法被广泛用于对环境中污染物进行定性和定量的测定。四、监测技术概述监测技术包括采样技术、测试技术和数据93（二）生物技术

这是利用生物在污染环境中所产生的各种反映信息来判断环境质量的方法，是一种最直接也是一种综合的方法。生物监测包括生物体内污染物含量的测定；观察生物在环境中受伤害症状；生物的生理生化反应；生物群落结构和种类变化等手段来判断环境质量。（二）生物技术94第二节生物传感器一、概述传统的环境监测方法通常采用离线分析方法，其缺点是：分析速度慢，操作复杂，且需要昂贵仪器，不适宜进行现场快速监测和连续在线分析。建立和发展连续、在线、快速的现场监测体系尤其重要。

生物传感器实际上是一类特殊的化学传感器。国际纯粹和应用化学联合会对化学传感器的定义为：一种小型化的、能专一和可逆地对某种化合物或某种离子具有应答反应，并能产生一个与此化合物或此离子浓度成比例地分析信号的传感器。第二节生物传感器一、概述生物传感器实95生物传感器是一种将生物感应元件的专一性与一个能够产生与待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的一种分析装置。最先问世的生物传感器是酶电极。20世纪70年代后，人们开始研究微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。生物传感器是一种将生物感应元件的专一性与一个能够产生96二、生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由敏感元件，即生物元件和信号传导器组成。生物元件：是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等。传导器：主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。二、生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由敏感元件，即生97生物传感器的基本原理如下图所示：生物传感器的基本原理如下图所示：98生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单元）和待测物质之间的相互作用，有以下几种类型：（1）将化学信号转化为电信号已研究的大部分生物传感器的工作原理均属于这种类型。（2）将热变化转化为电信号（3）将光效应转化为电信号（4）直接产生电信号方式生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单99三、生物传感器的分类一般可从以下三个角度进行分类：1.根据传感器输出信号的产生方式（1）生物亲和型生物传感器S+RSR底物受体（2）代谢型或催化型生物传感器S+RSRP底物受体生成物三、生物传感器的分类一般可从以下三个角度进行分类：1002.根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、免疫传感器等。3.根据生物传感器的信号转化器可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等2.根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为：酶传感器101环境生物监测与安全性评价课件102四、生物传感器的特点1.根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛。2.测定时一般不需要样品预处理，也不需加入其他试剂。3.由于它的体积小，可以实现连续在线监测。4.响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。5.传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及。四、生物传感器的特点1.根据生物反应的特异性和多样性,理论上103酶传感器它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。例如,脲在尿素酶催化下发生反应1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。五、生物传感器在环境监测中的应用酶传感器五、生物传感器在环境监测中的应用104环境生物监测与安全性评价课件105葡萄糖电极缺点:(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时,响应电流明显下降而影响检测限;(3)传感器响应性能受溶液pH值和温度影响较大葡萄糖电极缺点:106环境生物监测与安全性评价课件1072.微生物传感器微生物传感器分为两类：一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧,可以氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。装置是：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理是：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的.2.微生物传感器微生物传感器分为两类：108例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时,均消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因109环境生物监测与安全性评价课件1103.BOD生物传感器利用生物传感器的原理，以微生物的单一菌种或混合种群作为BOD微生物电极，由于水体中BOD物质的加人或降解代谢的发生，导致水中的微生物内外源呼吸方式的变化或转化，藕联着电流强弱信号的改变，一定条件下传感器输出的电流值与BOD的浓度呈线性关系。用于制作BOD生物传感器的微生物主要有用单一菌种如丝孢酵母、梭菌、芽孢杆菌及混合微生物种群如活性污泥制成的BOD传感器，还有用生物发光菌和嗜热菌的。3.BOD生物传感器111基本组成：基本组成：112存在问题：由于微生物培养不稳定，使传感器不能保持良好、稳定的运行；一种微生物不可能对各种废水中所有的有机物都产生响应，因此，用单一菌种制备的BOD传感器只适用于部分类型的废水；微生物细胞在测定废水中有毒物质时由于缺乏抗性，会出现“中毒”现象；用常温微生物组成的BOD微生物电极的使用寿命不长。存在问题：1134.免疫传感器抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能,在与抗原结合时,选择性强,灵敏度高，免疫传感器就是利用其双重功能将抗体或抗原和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变化,通过适当的传感器可检测这些参数,从而构成不同的免疫传感器，总的来说可分为两类:(1)非标记型;(2)标记型4.免疫传感器抗体对相应的抗原具有识别和结合114图10－6免疫传感器的原理如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成,加到待测样品中,酶标记的及未标记的黄曲霉毒素便会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应,测定酶标黄曲霉毒素与抗体的结合率,便可知样品中的含量。根据使用的信号转换器,有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器等。图10－6免疫传感器的原理如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄115免疫传感器在环境检测中的应用：检测农药：对于有机农药传感器检测不仅比色谱法检测更方便，而且检测精度也是分光光度法很难达到的。Li等制备出五氯酚(PCP)的两种抗原，获得PCP-BSA耦联物并免疫接种得到相应抗体，设计出一种快速经济的免疫检测法，能够在5mln之内检测出土壤样品中的PCP含量，检测限为1mg／L。还有除草剂草甘磷、谷连松等。检测有机物：Gauger等开发出一种可携带式的现场检测连续流动免疫传感器，预处理简单，能在5min之内测定土壤中的三硝基甲苯和环三亚甲基三硝胺，精确度可达到10μg／L。检测金属类物质：主要是重金属离子[cr(VI)，Pb(II)，Cu(II)，Cd(II)，Cr(III)，Hg(II)，Ag(II)，Co(II)，Sn(II)和Ni(II)等。Blake等将乙二胺四乙酸、二亚乙醛三胺五乙酸(DTPA)等与重金属离子Cd(II)，Co(II)，Pb(II)和U(VI)螯合后作半抗原制成单克隆抗体，利用竞争机制，制成免疫传感器荧光检测。检测微生物：Wong等开发出一种基于石英晶体微量天平(QCM)技术的免疫传感器检测沙门氏菌。在细胞数量线性范围105×108／ml内，该传感器检测沙门氏菌没有明显干扰，检测下限为104／ml。还可检测金黄色葡萄球菌和其他一些病毒和细菌。免疫传感器在环境检测中的应用：检测农药：对于有机农药传感器检116存在的问题：目前存在的问题在于，已得到的有害物质对应的抗体有限，固定后的抗体的稳定性也是免疫传感器发展的制约因素之一；传感器在测定后再生困难，需要重新固定分子识别膜等条件都给免疫传感器技术从实验室技术转化为商业化产品带来了困难。但是随着新的微型换能器的应用、具有良好稳定性的新抗体的开发及固定抗体的稳定剂的研制，免疫传感器在检测环境中痕量有害物质和堆肥化过程控制中的应用必将有更加广阔的前景。存在的问题：目前存在的问题在于，已得到的有害物质1175.DNA生物传感器分子生物学与生物技术的进展为研究以核酸探针为敏感元件的DNA生物传感器提供了可能。与酶和抗体不同，核酸识别层十分稳定，并且易于合成或再生以供重复使用。

DNA生物传感器是将核酸作为分子识别及检测层并与各种物理的、化学的换能器相结合而产生的一种可以在物质分子水平上进行快速检测、监控的微量分析技术。DNA生物传感器在稳定性、可重复性、快速性、便捷性、灵敏度等方面所表现出的优越性，使得它成为当今生物分析测量领域的热点。

5.DNA生物传感器分子生物学与生物技术的进118（1）核酸杂交生物传感器的原理DNA生物传感器依据DNA分子之间或DNA分子与其它物质的相互作用(也称杂化作用)所引起的各种变化，来记录、分析发生在传感器和探测目标之间的杂化反应，以完成对目标物的探测和监控。（1）核酸杂交生物传感器的原理DNA生物传感器依119用非螺旋的肽骨架替代DNA分子中的磷酸骨架合成出肽核酸(PNA)，他们合成的PNA中，含有与胸腺嘧啶相连的氨基单位，保留了DNA分子的基本杂化特征，同样可以识别双株DNA链中的互补物。用非螺旋的肽骨架替代DNA分子中的磷酸骨架合成出肽核酸(P120（2）污染物的检测DNA传感器除可用于受感染微生物的核酸序列分析；

检测污染物和其它环境有害物质：Pandey等人将双链DNA固化在柱面波导的表面形成DNA生物传感器，并结合流式注射系统，以测量荧光信号的强度来检测可与双链DNA发生嵌入反应的化合物；检测DNA的物理损伤；可用于研究污染物与DNA之间的相互作用，为解释污染物毒性作用机理提供了可能。（2）污染物的检测DNA传感器除可用于受感染微生物的1216.其他生物传感器6.1酚类微生物传感器

属于酶传感器。用酶电极安培传感器检测酚类化合物时，电极表面的酶分子被氧和过氧化氢氧化，接着被酚类化合物重新还原，酚类主要转化为苯醌或酚自由基，这些产物通常具有电化学活性，能在相对于饱和甘汞电极（SCE)0V以下的电位还原，还原电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。6.其他生物传感器属于酶传感器。用酶电极安培1226.2阴离子表面活性剂传感器包括能降解烷基苯磺酸（LAS)的细菌和一个氧电极。当阴离子表面活性剂存在时，细菌的呼吸作用增加，导致溶解氧变化。6.3水体富营养化监测传感器引起水体富营养化的蓝细菌细胞体内有藻青素，它显示的荧光光谱不同于其他的微生物，从而用对荧光敏感的生物传感器就能监测蓝细菌的浓度。6.2阴离子表面活性剂传感器包括能降解烷基苯1236.4生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮6.5检测有毒有害物质的生物传感器6.6空气和废气监测传感器（1）CO2传感器（2）亚硫酸盐传感器（3）甲烷传感器6.4生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮124第三节PCR技术PCR的概念PCR反应原理PCR反应体系和方法PCR反应特点PCR类型PCR技术在环境检测中的应用第三节PCR技术PCR的概念125一、PCR的概念PCR概念的提出：1983，KaryMullis定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。一、PCR的概念PCR概念的提出：1983，KaryMul126引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA127Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。1988年Saiki等从温泉（

Hot

spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。thermusaquaticusMullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA128

此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在

1989

年，Science

将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子

(Molecule

of

the

year)此酶具有以下特点：129在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

二、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板130

体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物5’3’体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类131加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以132PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退133三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变134

总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶1反应体系总体积135PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程PCR技术的基本过程(1)模板DNA预变性模板DNATa136PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次PCR技术的基本过程(2)Taq酶循环仪94℃Taq酶7137琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1381）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。1）PCR反应成分（1）模板3PCR反应条件（2）引物浓度139（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度；四种dNTP浓度应相等；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（4）dNTP（5）Mg2+1402）循环参数变性

使双链DNA解链为单链，94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75℃,一般为72℃，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次，次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加2）循环参数（3）延伸141经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever经典循环参数（500bp以内）94℃30142四、PCR反应的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍四、PCR反应的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达231432）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决144引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。引物设计：1453）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可146目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子1471）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针五、PCR的类型1）不对称PCR五、PCR的类型148

高浓度引物低浓度引物高浓度引物低浓度引物1492)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互150环境生物监测与安全性评价课件151电泳引物123412343）多重PCR（复合PCR）设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物123412343）多重PCR（复合PCR）1524）标记PCR（LP-PCRLabelledprimers)利用同位