DNA的生物合成7课件

第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*1第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*11865年，孟德尔提出遗传因子的概念。1910年，摩尔根提出基因位于染色体。1909年，约翰逊据希腊文“给予生命”之义，用“基因(gene)”替代了“遗传因子(geneticfactor)”。*21.基因概念的提出和发展中心法则的提出和发展1865年，孟德尔提出遗传因子的概念。1910年，摩尔根提格里非斯和艾弗里的肺炎双球菌转化实验赫尔希和沙斯的T2噬菌体侵染细菌实验

*32.遗传物质化学本质的探索遗传物质是DNA格里非斯和艾弗里的肺炎双球菌转化实验*32.遗传物质化学本质FranklinDNAX射线衍射图谱查戈夫等发现：①A=T，G=C

Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型

*43.DNA双螺旋结构模型FranklinDNAX射线衍射图谱查戈夫等发现：①A=DNARNAProtein中心法则TheCentralDogma1958F.Crick翻译转录反转录复制复制中心法则的补充：①1965年发现RNA复制②1970年发现逆转录酶*54.中心法则的提出和发展DNARNAProtein中心法则翻译转录反转录复制复制中心复制的基本规律第一节*6复制的基本规律第一节*6DNA复制的概念:复制亲代DNA子代DNA*7亲代DNA为模板，按碱基配对的原则,合成两个完全相同的子链DNA分子的过程。DNA复制的概念:复制亲代DNA子代DNA*7亲代DNA为模复制的基本规律半保留复制

(semi-conservativereplication)双向复制

(bidirectionalreplication)半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)*8复制的基本规律半保留复制双向复制半不连续复制*8一、半保留复制亲代DNA子代DNA模板一、半保留复制亲代DNA子代DNA模板图12-1DNA复制理论上有三种可能形式*10图12-1DNA复制理论上有三种可能形式*101958,M.Meselson

&F.W.Stahl设计的实验*11(1)N15培养基上培养(2)N14培养基上培养(3)培养不同时间后提取DNA(4)DNA于密度梯度介质(5)离心N14对照组DNAN15亲代DNAN14第1代DNAN14第2代DNA1958,M.Meselson&F.W.Sta子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。

半保留复制的意义*12子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗二、双向复制DNA复制从固定的复制起始点(origin，Ori)开始，分别向两个方向进行解链、复制，称为双向复制。复制叉复制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA复制：单点双向复制*13二、双向复制DNA复制从固定的复制起始点(oriOri是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。这些短重复序列能被复制起始因子所识别并结合；一般富含AT碱基。①由多个独特的短重复序列组成；*14共同特征：Ori是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。这些短重A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC原核DNA复制：单点双向复制A.环状双链DNA及复制起始点oriterA5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核DNA复制：多点双向复制复制子长度两个相邻复制起始点之间的距离定为一个复制子长度。*16复制子(replicon)：独立完成复制的功能单位。

复制子5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核三、复制的半不连续性35353´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)3´5´3´5´*17三、复制的半不连续性35353´5´领头链随从链

半不连续性在DNA复制过程中，领头链连续复制，随从链不连续复制的现象。

冈崎片段(okazakifragment)

指不连续复制的片段原核:1000~2000个核苷酸（nt）

(相当于1个顺反子，即基因的大小)

真核:100~200个核苷酸（nt）(相当于1个核小体DNA的大小)*18半不连续性*18DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节*19DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节*19底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。参与DNA复制的物质:*20底物(substrate):参与DNA复制的物质:*20一、复制的化学反应

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol沿5→3方向延长；模板和引物；聚合反应特点：消耗2个高能磷酸键一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP(dNM活性：1.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作为模板，催化底物dNTP合成DNA的一类酶。全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol*22活性：1.53聚合酶活性，需要引物；二、DNADNA-pol的5´3´聚合作用3´5

53´3´5DNA-pol5

3´OHP*23DNA-pol的5´3´聚合作用3´553´3´53´5´外切酶5´3´外切酶5´3´内切酶3´5´外切酶5´3´外切酶外切酶与内切酶作用图解*245´3´3´5´外切酶5´3´外切酶5´3´内切酶3´5´外（一）原核生物的DNA聚合酶共同点：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同点：DNA-polⅠ还有53外切酶活性。*25（一）原核生物的DNA聚合酶共同点：1.53的聚大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能*26大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能*26功能：对复制中的错误进行校读，对复制

和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ(109kD)*271959年诺贝尔生理学医学奖得主功能：对复制中的错误进行校读，对复制DNA-polⅠ(1沿5→3方向延长；需模板和引物；消耗2个高能磷酸键。(1)53

的聚合活性的功能:沿5→3方向延长；需模板和引物；消耗2个高能磷酸键。(1(2)DNA-pol

I

3´5´外切酶活性的功能校读（proofread）功能5´3´GC将错配的核苷酸从引物链的3′端除去

*29(2)DNA-polI3´5´外切酶活性的功能校读（(3)DNA-pol

I

5´3´外切酶活性的功能切除引物，切除突变片段5´3´*30(3)DNA-polI5´3´外切酶活性的功能切除引323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

*31323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因突变，细菌依然存活；对模板的特异性不高；它参与DNA损伤的应急状态修复。

*32DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因*由A.Kornberg的二儿子TomB.Kornberg发现的。

DNA-polⅢ(含10多个亚基的异二聚体)核心酶:由α、ε、θ构成。*33功能:是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

*由A.Kornberg的二儿子TomB.KornbeDNA-polⅢ同时合成领头链和随从链*34DNA-polⅢ同时合成领头链和随从链*34

（二）真核生物的DNA聚合酶*35（二）真核生物的DNA聚合酶*35三、复制的保真性(fidelity)

（1）按照碱基配对规律进行复制，突变率约为1/103；

（2）DNA聚合酶对模板的依赖性和对碱基的选择，使子链与母链能准确配对,突变率降低到1/104~5；

（4）DNA修复系统和复制起始必须利用引物等机制，使突变率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性实现的即时校读(proofread)，可使突变率由1/104~5降低到1/106~8；*36三、复制的保真性(fidelity)（1）按照碱基配对四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化

DNA复制涉及DNA双螺旋构象变化*37解螺旋酶和单链DNA结合蛋白引物酶DNA拓扑异构酶四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化DNA复制涉及D

种类：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白

解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿着随从链的模板，从5’→3’方向，促使复制叉向前延伸；

rep蛋白(六聚体)：沿着领头链的模板，从3’→5’方向向前移动，促使双链不断解开；（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，使DNA解旋和解链成单链。*38种类：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿解螺旋酶和单链DNA结合蛋白协同作用单链DNA结合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)功能：维持模板单链状态并保护单链的完整。*39解螺旋酶和单链DNA结合蛋白协同作用单链DNA结合蛋（二）引物酶(primase)DNA复制时，利用DNA模板合成一段长度从几个到几十个核苷酸的短链RNA序列，为DNA聚合酶提供游离3’-OH端延伸合成DNA链。原核细胞的引物酶是专用于合成引物的RNA聚合酶

真核细胞的引物酶是DNA聚合酶α的两个小亚基。

*40

病毒的引物酶多样化。

（二）引物酶(primase)DNA复制时，利用DNA模板合DNA拓扑异构酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其重新连接的核酸酶。功能：快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。

（三）DNA拓扑异构酶

(DNAtopoisomerase)

*41DNA拓扑异构酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其

原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：TopoⅠ、TopoⅡ和TopoⅢ

原核生物：TopoⅡ将前方的正超螺旋转变为负超螺旋；TopoⅠ使DNA变为松弛状态，与转录有关。

真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通过切断、旋转和再连接，理顺DNA链。

*42原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：TopoⅠ、DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋DNA双螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*43DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋DNA双螺旋正超螺旋原核To不需ATP切割DNA双链；ATP供能将DNA分子转变成负超螺旋再连接切口。不需ATP切割双链DNA中的一条链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

临床上使用的喜树碱、鬼臼乙叉甙等抑制Topo酶活性。作用机制*44不需ATP切割DNA双链；ATP供能将DNA分子转变成负超螺五、DNA连接酶(DNAligase)除去RNA引物后，间隙由DNA-polⅠ填补成DNA，缺口由DNA连接酶催化相邻冈崎片段间的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯键。注意：不能连接DNA单链或RNA单链。AMP+PPi*45五、DNA连接酶(DNAligase)除去RNA引物后

在复制中起最后接合缺口(双链中的单链

缺口)的作用；在DNA修复、重组及剪接过程中起缝合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶功能*46在复制中起最后接合缺口(双链中的单链DNA连接酶功能*4

参与DNA复制的主要因子和酶参与DNA复制的主要因子和酶DNA生物合成过程第三节TheProcessofDNAReplication*48DNA生物合成过程第三节TheProcessofDNA（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

人为分成：起始、延长和终止三个阶段。引物合成DNA解链引发体生成1.DNA复制起始点的辨认结合与解链原核生物DNA的复制有一个特定的复制起始点；E.coli的复制起始点称为oriC，由245bp的保守序列和控制元件组成。*49（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的上游有3组13bp串连重复序列，为DnaB(解螺旋酶)和DnaC识别结合的DNA解链元件。

下游有2对9bp反向重复序列,为DnaA蛋白(起始因子)识别结合位点辨认oriC并解链主要需要6种蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(类组蛋白)、SSB、拓扑酶*50上游有3组13bp串连重复序列，为DnaB(解螺旋酶)和D引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶SSB引物SSBHO3'(DnaG)(DnaG)引发体：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA复制起始区域的复合结构。引物：是由引物酶催化合成的短链RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引发体的形成和引物*51解螺旋酶(DnaB)DnaC引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶（二）复制的延长(elongation)在DNA-polⅢ催化下，按碱基互补原则，dNTP以磷酸二酯键相连接，逐个加入延长中的子链上。

*52（二）复制的延长(elongation)在DNA-polⅢ领头链：以一段RNA引物开始合成后，通常一直继续下去。*53领头链：*53随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎

片段。*54随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎*54在营养丰富培养基，E.Coli每20分钟即可分裂一次；其基因组碱基数为4.6×106bp,

DNA为单点双向复制，可推算出复制速度约115kb/min(1,900bp/s)；真核染色体DNA为多点双向复制，复制叉移动速度约1～3kb/min(16~50bp/s)；复制子长度为100～200kb，约30～60分钟内完成复制(25~110bp/s)；完成染色体复制时间通常要用6～8小时。*55在营养丰富培养基，E.Coli每20分钟即可分裂1.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合点就是复制的终止点。（三）复制的终止oriter

E.coli8232SV40oriter500*561.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合（三）复制的终2.终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白识别结合终止子序列并具有反解旋酶活性，Tus-ter复合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止复制叉前进。

Tus蛋白还可造成复制体解体；解体后大约仍有10～100bp未被复制，可通过修复方式填补这一空缺。*572.终止区含有多个约22bp的终止子(terminator3.随从链上不连续性片段的连接*583.随从链上不连续性片段的连接*58WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerintheDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*59WhenDNAreplicated,itsstran*60半保留复制

双向复制半不连续复制第2节DNA复制的酶学和拓扑学变化第1节DNA复制的基本规律第3节DNA复制的基本过程参与DNA复制的物质:一、复制的化学反应

二、DNA聚合酶三、复制的保真性(fidelity)四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化

五、DNA连接酶一、原核生物的DNA生物合成:

起始、延长和终止*60半保留复制双向复制半不连续复制第2节DNA复制的二、真核生物的DNA生物合成

复制起始点多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢、参与复制的酶种类和数量更多更复杂。细胞完成一轮分裂的过程称为细胞周期(cellcycle)，分为4期；在良好营养条件下培养细胞，历时约24小时。

复制仅发生在细胞分裂的合成期(S期)，而且只复制一次。*61二、真核生物的DNA生物合成复制起始点多、冈崎（一）复制的起始特点：起始点称自主复制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),

含有11bp富含AT的核心

序列的片段[A(T)TTTATA(G)TTTA(T)];可被起始识别复合体

(originrecognitioncomplex,ORC)识别结合（在Cdc6和MCM2~7的协助下）。多起点（染色体上有千个复制子）时序性（分组激活，非同步进行）（一）复制的起始特点：3、酶和蛋白因子：

DNA-pol

/ε（引物酶活性/填补空缺）

DNA-pol（解螺旋酶及聚合酶活性）

增殖细胞核抗原(PCNA)

拓扑异构酶(TopoI,TopoII)

复制因子(RF，如：RFA、RFC)

4、通过细胞周期实现对DNA复制的调节：

S期周期蛋白cyclin依赖性激酶CDK磷酸化前复制复合物(pre-RC:MCM2~7-ORC/Cdc6-MCM2~7)激活，调控细胞周期进入S期。

*633、酶和蛋白因子：4、通过细胞周期实现对DNA复制的调节：领头链3535亲代DNA5335随从链（二）复制的延长DNA-polδ：在PCNA和RF-C协同下，替代DNA-polα继续催化领头链和随从链合成。DNA-polα：催化10个碱基引物和头20~30个碱基组成的DNA合成；*64领头链3535亲代DNA5335随从链（二）3`5`3`5`5`3`核小体引物注：当随从链延长了大致相当于一个或若干个核小

体的长度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物长度。*653`3`5`核小体引物注：当随从链延长了大致相当于一个或若干5’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’OP5’5’P3’OH真核生物染色体DNA是线性结构，新链两端的引物被去除后，新链和母链分别留下一段空隙和一段单链DNA。

（三）复制终止和端粒酶引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol

）连接（连接酶）1、复制终止基本过程*665’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’O

两端单链DNA母链不填补成双链，就会被DNase酶解，造成子代染色体末端缩短。*67两端单链DNA母链不填补成双链，就会被DNase酶解端粒染色体端粒(telomere)是指真核生物染色体末端DNA与它的结合蛋白紧密结合而形成的特殊结构。端粒的功能：

☆稳定染色体末端结构；☆防止染色体间末端连接；☆补偿DNA5’末端在清除RNA引物后造成的空缺。*68端粒染色体端粒(telomere)是指真核生物染色端粒的结构特点TTTTGGGGTTTTGGGG…共同结构是富含(TmGn)x重复序列，重复的次数由几十到数千不等，可反折成二级结构。引物水解后染色体的3’端比5’端伸出约12～16个单核苷酸链，该特殊结构可募集端粒酶(telomerase)。P5’HO3’3’OP5’5’P3’OH*69端粒的结构特点TTTTGGGGTTTTGGGG…共同结构是

端粒酶(telomerase)人端粒酶组成(1997,成功克隆)功能特点RNA和蛋白质组成的复合体，是特殊的反转录酶。①端粒酶RNA(hTR,能与染色体的3’ssDNA互补)②端粒酶协同蛋白1(hTP1)③端粒酶反转录酶(hTRT)

☆以自己的RNA组分作为模板，以染色体3’端的ssDNA作引物,延伸其底物DNA的3’端。*70端粒酶(telomerase)人端粒酶组成功能特点RN

端粒酶催化作用的爬行模型*71-OH-OH-OH(TmGn)x重复序列端粒酶催化作用的爬行模型*71-OH-OH-OH(TmG

正常细胞：细胞分裂

衰老死亡

细胞年轻化细胞分裂

导入端粒酶抗衰老端粒、端粒酶与细胞衰老*72正常细胞：细胞分裂衰老死亡细胞端粒、端粒酶与肿瘤某些肿瘤形成时可产生端粒缺失、融合、或缩短等现象。☆癌细胞启动端粒酶基因的表达，使染色体端粒稳定，癌细胞持续增殖、转移，获得永生。肿瘤细胞（约85%）端粒酶活性增高。☆端粒酶：组织良恶性鉴别指标，抑癌靶点。*73端粒、端粒酶与肿瘤某些肿瘤形成时可产生端粒缺失、融合、或缩*74*74真核与原核生物复制的主要区别*75真核与原核生物复制的主要区别*75反转录和其他的复制方式第四节*76反转录和其他的复制方式第四节*76逆转录酶(reversetranscriptase)RNA病毒逆转录(reversetranscription)现象RNADNA

逆转录酶为依赖RNA的DNA聚合酶(RNAdependentDNApolymerase,RDDP)。一、反转录酶和反转录

1.逆转录酶活性：以RNA为模板合成DNA2.RNaseH活性：水解RNA-DNA杂合分子中的RNA3.DNA-pol活性：以DNA为模板合成第二条DNA链逆转录酶没有3′→5′外切酶活性,无校对功能。*77复制引物：病毒自身的tRNA的3′-OH。逆转录酶(reversetranscriptase)图12-18反转录酶催化RNA转变为双链cDNA的途径AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnARnaseHTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′B．试管内合成cDNA图12-18反转录酶催化RNA转变为双链cDNA的途径A*79反转录病毒细胞内的逆转录过程：受体:CD4辅受体：CCR5/RANTES

或CXCR4/SDF-1gp120*79反转录病毒细胞内的逆转录过程：受体:CD4辅受体：CC二、逆转录研究的意义

（1）扩展了中心法则；表明RNA可同时兼有遗传信

息传代与表达的功能。（2）对反转录病毒的研究，有助于肿瘤和艾滋等疾

病发病机制和诊治的研究。（3）cDNA法、反转录病毒载体已成为基因工程和

基因治疗的重要工具。

1964~1970,Baltimore、Temin和Dulbecco在RSV和MLV研究，发现反转录酶、肿瘤病毒和细胞遗传物质间的相互作用，获1975诺贝尔生理/医学奖。*80二、逆转录研究的意义（1）扩展了中心法则；表明RNA可AZT(3’叠氮-2’,3’双脱氧胸腺核苷)是已用于艾滋病临床治疗的抑制反转录酶的药物AZT经T淋巴细胞吸收后转变为AZT三磷酸酯。*81PPP-一方面AZT三磷酸酯与HIV反转录酶有高亲和力，竞争性抑制了酶对dNTP的结合；

另一方面AZT可被加接到合成中的DNA链3′端，但AZT没有3′-OH，故病毒DNA合成被迅速终止。AZT(3’叠氮-2’,3’双脱氧胸腺核苷)是已用于艾滋病三、滚动复制和D环复制

某些低等生物中存在一种单向复制的特殊方式——滚环复制（rollingcirclereplication）。如ΦΧ174和M13噬菌体，爪蟾卵rDNA。*82三、滚动复制和D环复制某些低等生物中存在一种单

线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）采用另一种单向复制的特殊方式，称为D-环或取代环式（displacementloop）复制。*83线粒体DNA（mitochondrialDNA,第五节DNA损伤(突变)与修复*84第五节DNA损伤(突变)与修复*84基因组DNA分子序列的异常变化，称为DNA突变(mutation)，或DNA损伤(DNAdamage)。一、突变的意义（1）突变是进化的分子基础（2）突变导致基因多态性(表型无差异)产生（3）突变是某些疾病的发病基础（4）突变可导致死亡*85基因组DNA分子序列的异常变化，称为DNA突变(mutati①物理因素:

紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射。②化学因素：

化学诱变剂，大多数是致癌物。③生物诱变剂：*如可移动遗传因子，即能在基因组中移

动的DNA序列。

如：病毒(如逆转录病毒)二、引发突变的因素*86①物理因素:②化学因素：③生物诱变剂：二、引发突变DNA的碱基错配又称点突变(pointmutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。颠换1.错配(mismatch)三、突变的分子改变类型*87DNA的碱基错配又称点突变(pointmutation镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-Val

·

His

·

Leu

·

Thr

·

Pro·Val

·

Glu

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-Val

·His

·

Leu

·Thr

·

Pro·Glu

·

Glu

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因*88镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-Val·H2.缺失、插入和框移突变缺失：DNA丢失一个碱基或一段核苷酸链。插入：DNA内插入一个碱基或一段核苷酸链。缺失或插入都可导致框移(frameshift)突变或称移码突变：*892.缺失、插入和框移突变缺失：DNA丢失一个碱基或一段核苷谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变*90谷酪蛋由基因重排引起两种地中海贫血基因型3.重排(rearrangement)DNA分子内较大片段的交换，又称为重组或重排。*91由基因重排引起两种地中海贫血基因型3.重排(rearrang四、DNA损伤的修复DNA修复(DNArepairing)直接修复(directrepairing)

切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)SOS修复(SOSrepairing)修复的主要类型对已改变的DNA分子进行补救的措施，使其回复为原有的结构。*92四、DNA损伤的修复DNA修复(DNArepairin1.光修复(lightrepairing)光修复酶

UV（一）直接修复2.断裂处直接修复可见光(300~600nm)能激活细胞内的光修复酶(photolyase)。由电离辐射等引起DNA损伤断裂，断裂处两侧的3′和5′端保持完整，可进行直接修复。*931.光修复(lightrepairing)光修复酶UV（二）切除修复在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，同时以另一条完整的链为模板，合成出被切除部分的空隙，使DNA恢复正常结构的过程。①碱基切除修复(baseexcisionrepair,BER)：单个碱基突变以BER方式进行修复。②核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER):

4种蛋白质：UvrA(损伤识别)、UvrB(DNA变性)、UvrC(内切酶)和UvrD(解旋酶)*94（二）切除修复在一系列酶的作用下，将DNA分子图12-23切除修复方式：碱基切除修复和核苷酸切除修复

*人类着色性干皮病(xerodermapigmentosis,XP;隐性遗传病)，由相关基因(XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG)缺陷引起。图12-23切除修复方式：碱基切除修复和核苷酸切除修复*

（三）重组修复（recombinationrepair）是先复制后修复。*96（三）重组修复（recombinationrep（四）SOS修复(SOSrepair)是指DNA损伤严重，细胞处在复制难以继续进行的危急状态下，诱发产生的一种应急修复方式。

能诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质产生，如uvr，rec基因产物，调节蛋白LexA等，构成一个网络式调控系统。

能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，故在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高变异率。*97（四）SOS修复(SOSrepair)是指DNA原核生物和真核生物DNA复制的比较原核生物和真核生物DNA复制的比较第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*99第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*11865年，孟德尔提出遗传因子的概念。1910年，摩尔根提出基因位于染色体。1909年，约翰逊据希腊文“给予生命”之义，用“基因(gene)”替代了“遗传因子(geneticfactor)”。*1001.基因概念的提出和发展中心法则的提出和发展1865年，孟德尔提出遗传因子的概念。1910年，摩尔根提格里非斯和艾弗里的肺炎双球菌转化实验赫尔希和沙斯的T2噬菌体侵染细菌实验

*1012.遗传物质化学本质的探索遗传物质是DNA格里非斯和艾弗里的肺炎双球菌转化实验*32.遗传物质化学本质FranklinDNAX射线衍射图谱查戈夫等发现：①A=T，G=C

Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型

*1023.DNA双螺旋结构模型FranklinDNAX射线衍射图谱查戈夫等发现：①A=DNARNAProtein中心法则TheCentralDogma1958F.Crick翻译转录反转录复制复制中心法则的补充：①1965年发现RNA复制②1970年发现逆转录酶*1034.中心法则的提出和发展DNARNAProtein中心法则翻译转录反转录复制复制中心复制的基本规律第一节*104复制的基本规律第一节*6DNA复制的概念:复制亲代DNA子代DNA*105亲代DNA为模板，按碱基配对的原则,合成两个完全相同的子链DNA分子的过程。DNA复制的概念:复制亲代DNA子代DNA*7亲代DNA为模复制的基本规律半保留复制

(semi-conservativereplication)双向复制

(bidirectionalreplication)半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)*106复制的基本规律半保留复制双向复制半不连续复制*8一、半保留复制亲代DNA子代DNA模板一、半保留复制亲代DNA子代DNA模板图12-1DNA复制理论上有三种可能形式*108图12-1DNA复制理论上有三种可能形式*101958,M.Meselson

&F.W.Stahl设计的实验*109(1)N15培养基上培养(2)N14培养基上培养(3)培养不同时间后提取DNA(4)DNA于密度梯度介质(5)离心N14对照组DNAN15亲代DNAN14第1代DNAN14第2代DNA1958,M.Meselson&F.W.Sta子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。

半保留复制的意义*110子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗二、双向复制DNA复制从固定的复制起始点(origin，Ori)开始，分别向两个方向进行解链、复制，称为双向复制。复制叉复制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA复制：单点双向复制*111二、双向复制DNA复制从固定的复制起始点(oriOri是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。这些短重复序列能被复制起始因子所识别并结合；一般富含AT碱基。①由多个独特的短重复序列组成；*112共同特征：Ori是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。这些短重A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC原核DNA复制：单点双向复制A.环状双链DNA及复制起始点oriterA5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核DNA复制：多点双向复制复制子长度两个相邻复制起始点之间的距离定为一个复制子长度。*114复制子(replicon)：独立完成复制的功能单位。

复制子5’3’ARSARSARSARS5’3’5’5’3’3’真核三、复制的半不连续性35353´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)3´5´3´5´*115三、复制的半不连续性35353´5´领头链随从链

半不连续性在DNA复制过程中，领头链连续复制，随从链不连续复制的现象。

冈崎片段(okazakifragment)

指不连续复制的片段原核:1000~2000个核苷酸（nt）

(相当于1个顺反子，即基因的大小)

真核:100~200个核苷酸（nt）(相当于1个核小体DNA的大小)*116半不连续性*18DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节*117DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节*19底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。参与DNA复制的物质:*118底物(substrate):参与DNA复制的物质:*20一、复制的化学反应

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol沿5→3方向延长；模板和引物；聚合反应特点：消耗2个高能磷酸键一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP(dNM活性：1.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作为模板，催化底物dNTP合成DNA的一类酶。全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol*120活性：1.53聚合酶活性，需要引物；二、DNADNA-pol的5´3´聚合作用3´5

53´3´5DNA-pol5

3´OHP*121DNA-pol的5´3´聚合作用3´553´3´53´5´外切酶5´3´外切酶5´3´内切酶3´5´外切酶5´3´外切酶外切酶与内切酶作用图解*1225´3´3´5´外切酶5´3´外切酶5´3´内切酶3´5´外（一）原核生物的DNA聚合酶共同点：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同点：DNA-polⅠ还有53外切酶活性。*123（一）原核生物的DNA聚合酶共同点：1.53的聚大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能*124大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能*26功能：对复制中的错误进行校读，对复制

和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ(109kD)*1251959年诺贝尔生理学医学奖得主功能：对复制中的错误进行校读，对复制DNA-polⅠ(1沿5→3方向延长；需模板和引物；消耗2个高能磷酸键。(1)53

的聚合活性的功能:沿5→3方向延长；需模板和引物；消耗2个高能磷酸键。(1(2)DNA-pol

I

3´5´外切酶活性的功能校读（proofread）功能5´3´GC将错配的核苷酸从引物链的3′端除去

*127(2)DNA-polI3´5´外切酶活性的功能校读（(3)DNA-pol

I

5´3´外切酶活性的功能切除引物，切除突变片段5´3´*128(3)DNA-polI5´3´外切酶活性的功能切除引323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

*129323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因突变，细菌依然存活；对模板的特异性不高；它参与DNA损伤的应急状态修复。

*130DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因*由A.Kornberg的二儿子TomB.Kornberg发现的。

DNA-polⅢ(含10多个亚基的异二聚体)核心酶:由α、ε、θ构成。*131功能:是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

*由A.Kornberg的二儿子TomB.KornbeDNA-polⅢ同时合成领头链和随从链*132DNA-polⅢ同时合成领头链和随从链*34

（二）真核生物的DNA聚合酶*133（二）真核生物的DNA聚合酶*35三、复制的保真性(fidelity)

（1）按照碱基配对规律进行复制，突变率约为1/103；

（2）DNA聚合酶对模板的依赖性和对碱基的选择，使子链与母链能准确配对,突变率降低到1/104~5；

（4）DNA修复系统和复制起始必须利用引物等机制，使突变率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性实现的即时校读(proofread)，可使突变率由1/104~5降低到1/106~8；*134三、复制的保真性(fidelity)（1）按照碱基配对四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化

DNA复制涉及DNA双螺旋构象变化*135解螺旋酶和单链DNA结合蛋白引物酶DNA拓扑异构酶四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化DNA复制涉及D

种类：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白

解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿着随从链的模板，从5’→3’方向，促使复制叉向前延伸；

rep蛋白(六聚体)：沿着领头链的模板，从3’→5’方向向前移动，促使双链不断解开；（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，使DNA解旋和解链成单链。*136种类：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿解螺旋酶和单链DNA结合蛋白协同作用单链DNA结合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)功能：维持模板单链状态并保护单链的完整。*137解螺旋酶和单链DNA结合蛋白协同作用单链DNA结合蛋（二）引物酶(primase)DNA复制时，利用DNA模板合成一段长度从几个到几十个核苷酸的短链RNA序列，为DNA聚合酶提供游离3’-OH端延伸合成DNA链。原核细胞的引物酶是专用于合成引物的RNA聚合酶

真核细胞的引物酶是DNA聚合酶α的两个小亚基。

*138

病毒的引物酶多样化。

（二）引物酶(primase)DNA复制时，利用DNA模板合DNA拓扑异构酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其重新连接的核酸酶。功能：快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。

（三）DNA拓扑异构酶

(DNAtopoisomerase)

*139DNA拓扑异构酶：既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其

原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：TopoⅠ、TopoⅡ和TopoⅢ

原核生物：TopoⅡ将前方的正超螺旋转变为负超螺旋；TopoⅠ使DNA变为松弛状态，与转录有关。

真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通过切断、旋转和再连接，理顺DNA链。

*140原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：TopoⅠ、DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋DNA双螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*141DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋DNA双螺旋正超螺旋原核To不需ATP切割DNA双链；ATP供能将DNA分子转变成负超螺旋再连接切口。不需ATP切割双链DNA中的一条链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

临床上使用的喜树碱、鬼臼乙叉甙等抑制Topo酶活性。作用机制*142不需ATP切割DNA双链；ATP供能将DNA分子转变成负超螺五、DNA连接酶(DNAligase)除去RNA引物后，间隙由DNA-polⅠ填补成DNA，缺口由DNA连接酶催化相邻冈崎片段间的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯键。注意：不能连接DNA单链或RNA单链。AMP+PPi*143五、DNA连接酶(DNAligase)除去RNA引物后

在复制中起最后接合缺口(双链中的单链

缺口)的作用；在DNA修复、重组及剪接过程中起缝合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶功能*144在复制中起最后接合缺口(双链中的单链DNA连接酶功能*4

参与DNA复制的主要因子和酶参与DNA复制的主要因子和酶DNA生物合成过程第三节TheProcessofDNAReplication*146DNA生物合成过程第三节TheProcessofDNA（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

人为分成：起始、延长和终止三个阶段。引物合成DNA解链引发体生成1.DNA复制起始点的辨认结合与解链原核生物DNA的复制有一个特定的复制起始点；E.coli的复制起始点称为oriC，由245bp的保守序列和控制元件组成。*147（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的上游有3组13bp串连重复序列，为DnaB(解螺旋酶)和DnaC识别结合的DNA解链元件。

下游有2对9bp反向重复序列,为DnaA蛋白(起始因子)识别结合位点辨认oriC并解链主要需要6种蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(类组蛋白)、SSB、拓扑酶*148上游有3组13bp串连重复序列，为DnaB(解螺旋酶)和D引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶SSB引物SSBHO3'(DnaG)(DnaG)引发体：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA复制起始区域的复合结构。引物：是由引物酶催化合成的短链RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引发体的形成和引物*149解螺旋酶(DnaB)DnaC引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶（二）复制的延长(elongation)在DNA-polⅢ催化下，按碱基互补原则，dNTP以磷酸二酯键相连接，逐个加入延长中的子链上。

*150（二）复制的延长(elongation)在DNA-polⅢ领头链：以一段RNA引物开始合成后，通常一直继续下去。*151领头链：*53随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎

片段。*152随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎*54在营养丰富培养基，E.Coli每20分钟即可分裂一次；其基因组碱基数为4.6×106bp,

DNA为单点双向复制，可推算出复制速度约115kb/min(1,900bp/s)；真核染色体DNA为多点双向复制，复制叉移动速度约1～3kb/min(16~50bp/s)；复制子长度为100～200kb，约30～60分钟内完成复制(25~110bp/s)；完成染色体复制时间通常要用6～8小时。*153在营养丰富培养基，E.Coli每20分钟即可分裂1.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合点就是复制的终止点。（三）复制的终止oriter

E.coli8232SV40oriter500*1541.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合（三）复制的终2.终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白识别结合终止子序列并具有反解旋酶活性，Tus-ter复合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止复制叉前进。

Tus蛋白还可造成复制体解体；解体后大约仍有10～100bp未被复制，可通过修复方式填补这一空缺。*1552.终止区含有多个约22bp的终止子(terminator3.随从链上不连续性片段的连接*1563.随从链上不连续性片段的连接*58WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerintheDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*157WhenDNAreplicated,itsstran*158半保留复制

双向复制半不连续复制第2节DNA复制的酶学和拓扑学变化第1节DNA复制的基本规律第3节DNA复制的基本过程参与DNA复制的物质:一、复制的化学反应

二、DNA聚合酶三、复制的保真性(fidelity)四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化

五、DNA连接酶一、原核生物的DNA生物合成:

起始、延长和终止*60半保留复制双向复制半不连续复制第2节DNA复制的二、真核生物的DNA生物合成

复制起始点多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢、参与复制的酶种类和数量更多更复杂。细胞完成一轮分裂的过程称为细胞周期(cellcycle)，分为4期；在良好营养条件下培养细胞，历时约24小时。

复制仅发生在细胞分裂的合成期(S期)，而且只复制一次。*159二、真核生物的DNA生物合成复制起始点多、冈崎（一）复制的起始特点：起始点称自主复制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),

含有11bp富含AT的核心

序列的片段[A(T)TTTATA(G)TTTA(T)];可被起始识别复合体

(originrecognitioncomplex,ORC)识别结合（在Cdc6和MCM2~7的协助下）。多起点（染色体上有千个复制子）时序性（分组激活，非同步进行）（一）复制的起始特点：3、酶和蛋白因子：

DNA-pol

/ε（引物酶活性/填补空缺）

DNA-pol（解螺旋酶及聚合酶活性）

增殖细胞核抗原(PCNA)

拓扑异构酶(TopoI,TopoII)

复制因子(RF，如：RFA、RFC)

4、通过细胞周期实现对DNA复制的调节：

S期周期蛋白cyclin依赖性激酶CDK磷酸化前复制复合物(pre-RC:MCM2~7-ORC/Cdc6-MCM2~7)激活，调控细胞周期进入S期。

*1613、酶和蛋白因子：4、通过细胞周期实现对DNA复制的调节：领头链3535亲代DNA5335随从链（二）复制的延长DNA-polδ：在PCNA和RF-C协同下，替代DNA-polα继续催化领头链和随从链合成。DNA-polα：催化10个碱基引物和头20~30个碱基组成的DNA合成；*162领头链3535亲代DNA5335随从链（二）3`5`3`5`5`3`核小体引物注：当随从链延长了大致相当于一个或若干个核小

体的长度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物长度。*1633`3`5`核小体引物注：当随从链延长了大致相当于一个或若干5’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’OP5’5’P3’OH真核生物染色体DNA是线性结构，新链两端的引物被去除后，新链和母链分别留下一段空隙和一段单链DNA。

（三）复制终止和端粒酶引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol

）连接（连接酶）1、复制终止基本过程*1645’PHO3’P5’3’OHO5’PP5’HO3’3’O

两端单链DNA母链不填补成双链，就会被DNase酶解，造成子代染色体末端缩短。*165两端单链DNA