方法学验证中各项指标的深度剖析课件

方法学验证中各项指标的深度剖析谢沐风上海市药品检验所xiemufeng@1方法学验证中各项指标的深度剖析谢沐风上海市药品检验所1一、线性试验

主成分含量测定以测定浓度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。

溶出（释放）度测定以释放量的10%～120%间选取5个点即可。

杂质含量用杂质对照品准确测定以杂质限度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。2一、线性试验主成分含量测定以测定浓度为1测定结果：

1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。

2）误差在哪里，应用时的注意事项。

3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。

个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。

4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。3测定结果：

1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。

2）误差唑来磷酸结构式4唑来磷酸结构式4引申使用：

1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙用。

2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。

3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。

4）国内只注重相关系数，不注重截距。5引申使用：

1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙二、精密度试验

重复性试验：连续进样6次。

中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。

浓度极低时才会不理想，加大进样量。

色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。6二、精密度试验重复性试验：连续进样6次。

中三、准确度试验用回收率来衡量

作法：在80%~120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。

已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。

一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好的！7三、准确度试验用回收率来衡量作法：在80四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。

有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。

8四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）系统适用性试验的配制方法：

在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。

介绍配制方法

——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！9系统适用性试验的配制方法：

在100％浓度的专属性试验验证图谱10专属性试验验证图谱10

存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。

强破坏试验的目的：

验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。11存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤●检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）

选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。

选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。

如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。12●检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的介绍该项检测的由来和历史背景

要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意DAD检测器的局限性，介绍“土办法”！

结果：目前从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是“走形式”？13介绍该项检测的由来和历史背景

要看主峰里是最小峰面积的设定

●

其设定，不是绝对值，而是相对值。

●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。

●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。14最小峰面积的设定

●其设定，不是绝对值，而是相对值。

●强力破坏试验

●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。

●氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变

●强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。15强力破坏试验

●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃四、检测限●

信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。

●

是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。16四、检测限●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系17有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系17积分参数的设定●积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。●采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。●供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。18积分参数的设定18方法学认证中的耐受性试验

是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。19方法学认证中的耐受性试验19方法学认证中溶液稳定性的全面判定不能单从主成分入手！还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！20方法学认证中溶液稳定性的全面判定20杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时间(h)峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比均未检出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％21杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时流速、柱温与溶剂的选择●在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。●柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。●溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。22流速、柱温与溶剂的选择22质量标准中制订有关物质的原则●采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。●采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。●不采用任何方式。23质量标准中制订有关物质的原则23典型强破坏试验图谱24典型强破坏试验图谱24方法学验证中各项指标的深度剖析谢沐风上海市药品检验所xiemufeng@25方法学验证中各项指标的深度剖析谢沐风上海市药品检验所1一、线性试验

主成分含量测定以测定浓度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。

溶出（释放）度测定以释放量的10%～120%间选取5个点即可。

杂质含量用杂质对照品准确测定以杂质限度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。26一、线性试验主成分含量测定以测定浓度为1测定结果：

1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。

2）误差在哪里，应用时的注意事项。

3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。

个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。

4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。27测定结果：

1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。

2）误差唑来磷酸结构式28唑来磷酸结构式4引申使用：

1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙用。

2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。

3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。

4）国内只注重相关系数，不注重截距。29引申使用：

1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙二、精密度试验

重复性试验：连续进样6次。

中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。

浓度极低时才会不理想，加大进样量。

色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。30二、精密度试验重复性试验：连续进样6次。

中三、准确度试验用回收率来衡量

作法：在80%~120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。

已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。

一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好的！31三、准确度试验用回收率来衡量作法：在80四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。

有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。

32四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）系统适用性试验的配制方法：

在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。

介绍配制方法

——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！33系统适用性试验的配制方法：

在100％浓度的专属性试验验证图谱34专属性试验验证图谱10

存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。

强破坏试验的目的：

验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。35存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤●检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）

选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。

选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。

如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。36●检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的介绍该项检测的由来和历史背景

要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意DAD检测器的局限性，介绍“土办法”！

结果：目前从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是“走形式”？37介绍该项检测的由来和历史背景

要看主峰里是最小峰面积的设定

●

其设定，不是绝对值，而是相对值。

●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。

●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。38最小峰面积的设定

●其设定，不是绝对值，而是相对值。

●强力破坏试验

●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。

●氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变

●强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。39强力破坏试验

●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃四、检测限●

信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。

●

是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。40四、检测限●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系41有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系17积分参数的设定●积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。●采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。●供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。42积分参数的设定18方法学认证中的耐受性试验

是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。43方法学认证中的耐受性试验19方法学认证中溶液稳定性的全面判定不能单从主成分入手！还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！44方法学认证中溶液稳定性的全面判定20杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时间(h)峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积