亲和层析法纯化胰蛋白酶 第一部分 实验内容简介0

亲和层析法纯化胰蛋白酶

第一部分实验内容简介

1内容摘要亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉及到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等因素的影响。亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合，形成具有高度专一性的亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分。本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，酶活性的测定等内容。通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。2实验目的方法掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法1.

3实验流程

鸡蛋清

Spharose4B

猪胰脏

↓↓↓提取↓活化

提取分离纯化↓↓↓

纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶联

激活↓↓

CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

亲和层析↓

酶促动力学

←

纯胰蛋白酶→酶活性测定

↓

酶蛋白含量测定1.

4要求掌握的技术柱层析技术SephadexG-25分子筛层析

DEAE-Cellulose离子交换层析CHOM–Sepharose4B亲和层析蛋白质提取技术

10%TCA提取鸡卵粘蛋白

3.5%乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原

蛋白含量测定技术消光系数法测定胰蛋白酶含量消光系数法测定鸡卵粘蛋白含量生物活性测定

胰蛋白酶比活性测定鸡卵粘蛋白抑制活性测定

亲和介质合成技术载体-Sepharose4B的前处理载体-Sepharose4B的活化活化载体-Sepharose4B的偶联第二部分实验方法

实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化

1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量:28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖,D-半乳糖,葡萄糖胺,唾液酸1.2化学稳定性耐热:在80℃条件下,理化性质不发生改变耐有机溶剂:在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度耐沉淀剂:在10%的TCA的溶液中不发生沉淀.1.3等电点性质等电点:pI在3.9-4.5之间溶液中的状态:在pH3.0的溶液中稳定,在pH8.0的溶液中容易分解鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态见表1。表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度

溶液pH值鸡卵粘蛋白

鸡卵清蛋白

等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑

1.2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：

每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10%pH1.15TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm离心15min。2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/LHCl将溶液精确调至pH3.5。量取体积。2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000rpm离心15min。2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。抽去残留丙酮。（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1SephadexG-25柱脱盐(1)溶胀：称取15gSephadexG-25放入500ml的烧杯中,加入200ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。(2)装柱：取一支30×3cm的层析柱，将溶胀好的SephadexG-25装柱，自然沉降。(3)处理：用2倍柱床体积的0.5mol/LNaCl溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。

(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。(5)上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。(6)收集：在检测仪上观察到开始出现峰时进行收集。见图1图1SephadexG-25分子筛层析分离图谱3.2Cellulose离子交换柱层析分离(1)溶胀：称取20gDEAE-Cellulose放入500ml的烧杯中,加入150ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时。(2)装柱：取一支20×3cm的层析柱，将溶胀好的DEAE-Cellulose装柱，自然沉降。(3)再生：用200ml0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH混合溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8.0。用200ml0.5mol/LHCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH6.0。(4)平衡：

用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。(5)上样：

将经SephadexG-25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样，用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，直到仪器绘出稳定的基线。流速控制在1.0ml/min左右。(6)洗脱：

用0.3mol/LNaCl-20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液。(7)收集：

在检测仪上观察到出现高峰时开始收集。见图2图2，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离3.3透析及丙酮沉淀(1)透析：将经DEAE-Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内，对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经BaCl2溶液检查无氯离子存在，即可。(2)调pH值：将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/LHCl精确调至pH4.0（最好一次调成功），量体积。(3)丙酮沉淀：加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在冰箱内静止4小时以上或过夜。(4)离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000rpm离心15min，收集沉淀。(5)干燥：将盛有鸡卵粘蛋白的离心杯放入真空干燥器中干燥。(6)收集鸡卵粘蛋白成品，冰箱保存。4活性测定(1)标准胰蛋白酶活性测定空白:1.5ml缓冲液→1.5ml底物混匀.样品:1.5ml缓冲液→1.5ml底物→胰蛋白酶10μl混匀,立即测定(2)自提鸡卵粘蛋白抑制活性测定空白:1.5ml缓冲液→1.5ml底物混匀.样品:1.5ml缓冲液→鸡卵粘蛋白10μl→胰蛋白酶10μl混匀放置2min以上→1.5ml底物,立即测定(3)鸡卵粘蛋白含量测定取透析液0.3ml稀释10倍,测定A280.3实验结果(1)计算鸡卵粘蛋白收率(2)计算标准胰蛋白酶的比活性(3)计算鸡卵粘蛋白的抑制活性。5试剂配制5.1公用试剂(1)10%TCA溶液,pH1.15,1500ml(50ml/组)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液,(内含0.2%CaCl2)200ml(3)2mmol/LBAEE底物溶液200ml(4)1mg/LTrypsin标准溶液10ml

5.2自配试剂(1)0.2mol,pH6.6,PBS缓冲液120ml(×10)(2)0.3mol/LNaCl–0.02mol/L,pH6.6,PBS缓冲液100ml(3)0.5mol/LHCl溶液200ml(4)0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH溶液200ml(5)0.5mol/LNaCl溶液250ml6时间安排

星期上午（8：00-12：00）下午（12：00-6：00）晚上一讲实验，配试剂提取鸡卵粘蛋白，装DEAE和G25柱，处理各柱

二离心，丙酮沉淀，平衡G25柱和DEAE柱，离心，去丙酮上G25柱脱盐，收集第一峰，上DEAE柱分离，收集第二峰，对蒸馏水透析过夜。

三换水，取样测粘蛋白抑制活性和标准胰蛋白酶活性，透析液调pH4，丙酮沉淀。继续测定标准酶活性和抑制活性，离心，收集沉淀物4℃干燥。结束实验

实验二亲和层析纯化胰蛋白酶1原理

鸡卵粘蛋白(ovomucoid,简称CHOM)，是胰蛋白酶的天然抑制剂，在pH7.8-8.0的缓冲溶液中二者发生专一性的亲和作用。以鸡卵粘蛋白为配基，偶联在已经活化的琼脂糖凝胶层析介质-Sepharose4B上，制备成鸡卵粘蛋白亲和层析介质（CHOM-Sepharose4B）。然后通过亲和层析法从胰蛋白酶粗提液中分离纯化胰蛋白酶。常用的载体活化与蛋配基偶联的方法有环氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反应的基本原理如下图所示：1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联

↓活化

↓偶联

↓亲和结合

↓洗脱

1.2溴化氰活化载体

与蛋白质配基的偶联

2亲和介质合成2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose4B)的活化2.1.1琼脂糖凝胶层析介质的处理称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内，用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗（少量多次），100ml蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。

2.1.2配方琼脂糖凝胶层析介质--QT410克蒸馏水7ml1,4二氧六环8ml2mol/LNaOH6.5ml

环氧氯丙烷1.5ml。

2.1.3活化将配制的好介质的三角瓶，放入45℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇活化2小时。停止活化，转移到G-3玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用100ml蒸馏水洗（少量多次），转移100ml到三角瓶中，准备偶联。

2.2偶联

称取约100mg鸡卵粘蛋白，用10ml0.1mol/LpH9.5Na2CO3缓冲液充分溶解。取0.1ml稀释10倍测定OD280，计算溶液的蛋白浓度。然后将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液，转移到100ml三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀。在40℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇偶联22小时左右，停止偶联。

2.3洗涤取一个洗净的500ml抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤，收集滤液，测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量。用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗，100ml蒸馏水抽洗，再用20ml亲和层析洗脱液洗涤。

将亲和介质转移到50ml的小烧杯内，加入20ml亲和层析平衡液，浸泡20分钟，脱气，装柱。

3胰蛋白酶粗提液的制备3.1胰蛋白酶的基本性质3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动物的胰脏或其他组织中。在底物的诱导下或激活剂的作用下，酶原的C端水解，去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶。-6肽胰蛋白酶原胰蛋白酶Ca+2激活剂3.1.2等电点与分子量：胰蛋白酶原的pI=10.8，分子量：24000Da胰蛋白酶的pI=8.9，分子量：23700Da

3.1.3稳定性胰蛋白酶在酸性环境中很稳定，在碱性环境中容易自溶，在提取的过程中要注意溶液的pH值。

当溶液的pH2.0容易变性pH=3.0生物活性稳定pH7.0容易自溶3.2胰蛋白酶原的提取(1)匀桨:取约30克猪胰脏，剥去结缔组织和脂肪，取净重20-25克左右,剪成碎块。转移到组织捣碎器内,加入150ml预冷的3.5%的乙酸酸化水,匀桨.(2)提取:转移到500ml烧杯中,用2mol/L硫酸调节pH值在3.5-4.0之间,10℃搅拌提取约4小时.(3)过滤:取一块纱布,折叠成四层,用水润湿,放在玻璃漏斗上,将胰蛋白酶原提取液过滤,收集滤液.(4)酸化:用2mol/L硫酸调节滤液的pH值至2.5-3.0之间,4℃冰箱静止沉淀4小时以上。(5)过滤:折叠滤纸过滤,收滤液。

3.3胰蛋白酶原的激活(1)调节pH值:用5mol/LNaOH将滤液精确调节pH值至pH8.0,量取溶液体积.(2)加激活剂:加入固体CaCl2使溶液的Ca+2终浓度达到0.1mol/L,然后加入约5mg结晶胰蛋白酶,混匀,激活.(3)激活时间:在4℃冰箱内激活12-16小时,在25℃恒温水浴中激活2-4小时.3.4停止激活(1)活性测定:取1ml上清液分别测定蛋白浓度和活性.具体操作见活性测定部分.(2)停止激活:等酶溶液的比活性达到1000u/mg左右,用2mol/L硫酸调节pH值到3.0.(3)过滤:滤纸过滤,滤去CaSO4沉淀,收集滤液,4℃冰箱保存.

4亲和层析分离胰蛋白酶(1)装柱:取一支层析柱(10×1.0cm),将合成好的亲和层析介质CHOM-Sepharose4B装入柱内,自然沉降.(2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡.(3)上样:将以经激活的胰蛋白酶提取液,用5mol/LNaOH精确调节pH值至pH8.0,滤纸过滤,取滤液上样.通过亲和介质的偶联量和胰蛋白酶粗提液的比活性,计算出上样所需体积.计算方法如下:

偶联mg数×0.86×1.3×104(u/mg)上样体积(ml)=粗酶浓度(mg/ml)×比活(u/mg)(4)平衡:

上完样以后,以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡,洗去未被吸附的杂蛋白。(5)洗脱:

等平衡到基线稳定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/LKCl溶液洗脱.收集洗脱峰。(6)亲和层析洗脱曲线:胰蛋白酶活性测定1胰蛋白酶活性测定1.1胰蛋白酶测定的基本原理

胰蛋白酶是一种蛋白水解酶,它除了能水解碱性氨基酸与其它氨基酸形成的肽键外,还能水解碱性氨基酸所形成的酯键,催化活性具有高度的专一性.因此,可以用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester,简称BAEE)为底物测定胰蛋白酶活性.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在碱性条件下,经胰蛋白酶作用水解去一个乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA),催化反应原理如图所示。

由于BAEE在波长253nm处的光吸收值远远弱于BA。因此，可以在加入酶为零点,测定在X分钟内的递增吸光值.通过酶的定义求出酶活性。

1.2测定胰蛋白酶活性的定义底物浓度C=1mmol/L光程:L=1cm波长:λ=253nm1个BAEE单位温度:T=25℃体积:V=3ml递增值:ΔO.D=0.001A1.3计算公式(1)活性单位ΔO.DBAEE单位(u/ml)=×N(稀释倍数)0.001

(2)比活性测得的BAEE活性单位(u/ml)BAEE单位(u/mg)=

胰蛋白酶浓度mg/ml)×加入体积(ml)

2鸡卵粘蛋白活性的测定

鸡卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制剂,通常1μg鸡卵粘蛋白能抑制0.86μg胰蛋白酶的活性(相当于1:0.86).在胰蛋白酶液中加入适量的鸡卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就会降低,胰蛋白酶递减的活性就是鸡卵粘蛋白的抑制活性.在同样的条件下分别测定出未加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2.将A1-A2就可以得到鸡卵粘蛋白的抑制活性.计算公式如下:(1)抑制活性

A1–A2BAEE单位(Iu/ml)=×N(稀释倍数)0.001A1：胰蛋白酶活性A2：加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性(2)抑制比活测得的BAEE活性单位(Iu/ml)BAEE单位(Iu/mg)=

鸡卵粘蛋白浓度(mg/ml)×加入体积(ml)

3蛋白质含量测定3.1消光系数的定义：在蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰。蛋白质分子中含有芳香族氨基酸的数量以及分子的紧密程度有差异，在280nm处的光吸收强弱不同。在一定的条件下，一种纯的蛋白质在在280nm处的光吸收值是一个常数。因此酶以纯的蛋白质在280nm处都有一个的消光系数A280。用符号表示为E1%1cm。这个符号的定义是指在浓度为1%（W/V）的蛋白质溶液中，测定光程为1cm的条件下，该蛋白的吸光值。如:胰蛋白酶的E1%1cm是13.5，是指胰蛋白酶的浓度为1%(g/100ml)，光程为1cm时光吸收值A280=13.5。当胰蛋白酶的浓度0.1g%(100mg/100ml)时，光程为1cm，光吸收值A280是1.35。当鸡卵粘蛋白的浓度1%(g/100ml)时，A280是4.13，浓度100%(mg/100ml)时，A280是0.413。在计算时大多数使用的蛋白浓度都是100mg/100ml，即浓度为1mg/1ml。计算出来的蛋白浓度单位可以用mg/ml表示。3.2计算公式A280×稀释倍数鸡卵粘蛋白浓度(mg/ml)=0.413

A280×稀释倍数胰蛋白酶浓度(mg/ml)=1.35

4实验结果4.1实验数据4.1.1鸡卵粘蛋白产率(mg/100ml蛋清)4.1.2亲和介质偶联率(mg/ml介质)4.1.3胰蛋白酶活性回收率(纯酶总活性/粗酶总活性)4.1.4亲和介质吸附率(mg/ml介质)4.1.5纯化倍数(纯酶比活/粗酶比活)4.2实验图表4.2.1SephadexG-25层析曲线4.2.2Cellulose层析曲线4.2.3亲和层析洗脱曲线4.2.4胰蛋白酶活性曲线积及卵粘蛋白抑制曲线

试剂配制

1公用试剂(1)10%TCA溶液,pH1.15,1500ml(50ml/组)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液,(内含0.2%CaCl2)200ml(3)2mmol/LBAEE底物溶液200ml(4)1mmol/LTrypsin标准溶液10ml(5)2mol/LNaOH溶液300ml(6.5ml/组)1.

2自配试剂(1)5mol/LNaOH溶液20ml(2)2mol/LH2SO4溶液20ml(3)0.3mol/LNaCl–0.02mol/L,pH6.6,PBS缓冲液100ml(4)3.5%,pH3.0HAC溶液200ml(5)0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/LKCl0.2%CaCl2)200ml(6)0.1mol/LpH2.5甲酸溶液(内含0.5mol/LKCl)100ml(7)0.1mol/LpH9.5NaCO3缓冲液50ml(8)0.5mol/LNaCl溶液200ml(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWo%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTk#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0