中药成分测定方法

中药成分测定方法第一节含量测定目标与意义

中药含量测定与化药有很大区分中药组成复杂，产生疗效不是某单一成份，检测任何一个活性成份均不能反应中药整体疗效。不过借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味有效成份、活性成份、指标性成份含量方法，对于控制中药质量起着不可替换主要作用。经过测定中药中有效成份、毒性成份或一些指标性成份含量来衡量其制剂工艺稳定性和中药材质量优劣，以确保中药质量，到达临床用药安全、有效目标。

中药成分测定方法2/922第二节含量测定样品处理

样品处理主要作用有：将被测成份有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提升分析方法重现性和准确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成份。衍生化不但可提升检测器灵敏度，还能够提升方法选择性。使试样形式及所用溶剂符合分析测定要求。中药成分测定方法3/923第二节含量测定样品处理

一、样品粉碎1.目标：是确保含量测定所取样品均匀而有代表性，提升测定结果精密度和准确度；是使样品中被测组分能更加快地完全提取出来。2.粉碎时注意事项：不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，所以可视实际情况进行粉碎过筛。防止污染样品。在粉碎样品时，要尽可能防止因为设备磨损或不洁净等原因而玷污样品，预防粉尘飞散或挥发性成份损失。过筛时，通不过筛孔部分颗粒决不能丢弃，必须重复粉碎或碾磨，让其全部经过筛孔。中药成分测定方法4/924第二节含量测定样品处理

二、样品提取对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和一些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。常见提取方法：冷浸法回流提取法连续回流提取法超声提取法超临界流体提取法中药成分测定方法5/925第二节含量测定样品处理

三、样品分离净化（一）沉淀法（二）蒸馏法（三）液一液萃取法（LLE）（四）色谱法

中药成分测定方法6/926第二节含量测定样品处理

（四）色谱法

吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液—固萃取（LSE）含有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最惯用，将在此做一介绍。LSE通常是指样品溶液加到装有适当固定相（净化剂）长5`～15cm，内径0.5～1cm色谱柱中，将被测成份保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成份进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成份进行测定。用这种选择性好而柱效较低方法进行样品净化分离，尤其适合用于一类总成份含量测定，也可将色谱柱流出样品深入用GC、HPLC、TCL分离后测定。LSE惯用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。中药成分测定方法7/927第二节含量测定样品处理

⒈硅胶、氧化铝等：

它们是传统吸附剂，多以0.07～0.15mm(200～100目)颗粒1～5g用于样品净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂样品加到柱上时非极性或低极性杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性溶剂洗脱被测成份，而强极性杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等测定。比如用ＵＶ法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大溶剂洗脱，则能够将杂质和被测成份分离。中药成分测定方法8/928⒉键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称C18或ODS）是惯用固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成份。也惯用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药品。该类LSE普通操作程序为：1)柱活化。用2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.5毫升水洗去柱中甲醇。2)上样。3)清洗。用2～5ml水清洗以除去弱保留亲水成份，如无机盐、氨基酸、亲水蛋白质、糖以及中等保留成份极性化合物、低肽等。4)洗脱。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脱大分子肽、甾体、较亲脂药品等强保留待测组分。第二节含量测定样品处理

中药成分测定方法9/929⒊大孔树脂：它可分为极性和非极性型极性丙烯酰胺聚合物;非极性苯乙烯和二乙烯苯共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相同，经过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。比如在测定复方归芪剂中黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性多糖杂质，再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂主要特点是表面主动大，传质速率较高和含有不一样极性及适于吸附较大分子。树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为1～2g，有时也用100～150mg来萃取血、尿中药品，操作程序类似ODS填料。第二节含量测定样品处理

中药成分测定方法10/9210第二节含量测定样品处理

⒋聚酰胺：它是惯用有机吸附剂，主要经过与溶质形成氢键而产生吸附作用。惯用于含酚、酸、醌类药品样品液净化分离，如测定黄酮时，用样品乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。

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⒌硅藻土、纤维素：

它们为惯用亲水型填料，其原理为分配作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为固定相，与水不混溶有机溶剂为流动相，较亲脂成份从固定相转移到流动相，而被洗脱，到达萃取目标。其萃取率较高（普通大于80%），无浓集作用，萃取液较纯净，但洗脱剂用量较大（普通大于5ml）硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。常见牌号为Extretut。纤维素柱使用与硅藻土柱相同。中药成分测定方法12/9212⒍离子交换树脂：憎水基质离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂一些性质，所以对于在水中溶解度不大药品、洗脱剂中需含一定量有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中离子，预防组分分解，更惯用于萃取样品液中可离解化合物。第二节含量测定样品处理

中药成分测定方法13/9213第二节含量测定样品处理

另外，近年来发展起来固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技术有良好应用前景。SPME是一个无溶剂萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。中药成分测定方法14/9214（五）消化法

对样品进行有机破坏，惯用于中药制剂中重金属检验。惯用破坏方法有湿法消化和干法消化法。⒈湿法消化：依据所用试剂不一样，下面介绍三种常见消化方法。（1）硝酸—高氯酸法该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适合用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。（2）硝酸—硫酸法该法适合用于大多数有机物质破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐金属离子测定，不宜采有此法。第二节含量测定样品处理

中药成分测定方法15/9215第二节含量测定样品处理

（3）硫酸—硫酸盐法本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐目标是为了提升硫酸沸点，以使样品破坏加速完全。同时预防硫酸在加热过程中过早地分解为SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法惯用于含砷或锑有机样品破坏，破坏后得到三价砷或锑。湿法消化所用仪器，普通为硅玻璃或硼玻璃制成凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白试验校正。操作时应在通风橱内进行。

中药成分测定方法16/9216第二节含量测定样品处理

⒉干法消化

本法是将有机物灼烧灰化以达分解目标，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适合用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品破坏。应用本法时要注意以下几个问题：1）加热灼烧时，控制温度在420℃以下，以免一些被测金属化合物挥发。2）灰化完全是否，直接影响测定结果准确度。如欲检验灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。中药成分测定方法17/9217第三节惯用定量分析方法

分类重量分析和滴定分析。化学分析法所用仪器简单，结果准确。主要用于测定制剂中含量较高一些成份及含矿物药制剂中无机成份，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定不足，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成份准确性不理想。中药成分测定方法18/9218第三节惯用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1、挥发法可测定含有挥发性或能定量转化为挥发性物质组分含量。如：①供试品干燥失重测定；②水分测定均属挥发法；③中药制剂分析中灰分及炽灼残渣测定等。2、萃取法是依据被测组分在互不相溶两相中溶解度不一样，到达分离目标。如①冰硼散中冰片含量测定；②地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；③昆明山海棠片中总生物碱含量测定；④甘草浸膏中甘草酸含量测定即采取萃取法。3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量方法，适合用于制剂中纯度较高成份。如①西瓜霜润喉片中西瓜霜含量测定；②苦参片中苦参总碱含量测定；③复方元胡注射液总碱测定。中药成分测定方法19/9219第三节惯用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。1、酸碱滴定法适合用于测定中药制剂中所含有生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分含量。①直接滴定：对于K·C≥10-8酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱含量测定、颠茄酊中生物碱含量测定。②间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质含量测定、草乌注射液中生物碱含量测定等。2、沉淀滴定法主要用于生物碱、生物碱氢卤酸盐及含卤素其它有机成份含量测定。中药成分测定方法20/9220第三节惯用定量分析方法3、配位滴定法包含EDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂含量。如①万氏牛黄清心丸等含量测定就采取硫氰酸铵法；②牛黄解毒片中石膏含量测定。4、氧化还原滴定法适合用于测定含有氧化还原性物质，如含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成份中药制剂。如①磁朱丸中全铁含量测定采取铈量法；②牛黄解毒片中雄黄含量测定；③丹皮酚注射液中丹皮酚含量测。中药成分测定方法21/9221第三节惯用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法该法是中药及其制剂含量测定一个惯用方法,含有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。该法要求被测成份本身或其显色产物对可见—紫外光含有选择性吸收。按测定波长数目不一样分为单波长光谱法和多波长光谱法。

中药成分测定方法22/9222第三节惯用定量分析方法（一）单波长光谱法

分类方法特点吸收系数法测定所配供试品溶液在要求波长吸收度，依据被测成份吸收系数（E1%1cm）计算其含量①对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收校正，吸收度准确度检定和杂散光检验②无需对照品，方法简便对照品比较法在一样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成份量应为后者中被测成份量100%±10%，用要求波测定二者吸收度，则可计算出供试品中被测成份浓度或含量对仪器要求较高标准曲线法配制一系列不一样浓度对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程（相关系数r≥0.999），即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液吸收度，就可求得供试品中被测成份浓度或含量。①本法对仪器精度要求不高，有时标准曲线不经过原点，只要重现性好也可使用②该法在比色法中最惯用中药成分测定方法23/9223第三节惯用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）

供试品溶液中若有各种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不一样程度重合时，则可经过测定各种波优点吸收度，依据吸收度加和性，采取适当数学处理方式进行多组分同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中某个组分。这就属于多波长光谱法范围。下面简明介绍用多波长法测定存在光谱干扰多组分样品中某个组分一些技术：双波长法（包含等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。中药成分测定方法24/9224第三节惯用定量分析方法优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知复杂样品，不过使用该法应慎重。首先因为中药及其制剂供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品变动性大，所以，使得其方法适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，当前极少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。再者，当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时，波长微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差。还有在实际工作中，因为测试条件改变，仪器精度与性能限制，多波长法不用吸收系数法，而采取标准品对比方法（惯用标准曲线法）来进行样品测定。中药成分测定方法25/9225第三节惯用定量分析方法三、薄层扫描法

薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱统计方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），对应仪器称为薄层扫描仪（ThinLayerChromatogramScanner）。薄层扫描法是用一定波长光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光斑点，或经激发后能发射出荧光斑点进行扫描，将扫描得到图谱及积分数据用于药品判别、杂质检验或含量测定。中药成分测定方法26/9226第三节惯用定量分析方法（一）基本原理

薄层扫描法是指薄层色谱斑点色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线。依据薄层扫描测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。中药成分测定方法27/9227第三节惯用定量分析方法1、薄层吸收扫描法基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。因为薄层板存在显著散射现象，斑点中物质浓度与吸光度关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点吸光度，说明了固定相散射参数SX对斑点中物质浓度与吸光度间关系影响，取得不一样散射参数SX时斑点A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。光源：钨灯和氘灯；灵敏度：在200-800nm波长范围内选择适当波长进行测定，其灵敏度可达ng级；适用范围：适合用于在可见、紫外区有吸收物质，及经过色谱前或色谱后衍生成上述化合物样品组分。中药成分测定方法28/92282、薄层荧光扫描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到10-50pg。适用范围：适合于本身含有荧光或经过适当处理后可产生荧光物质测定。Kubelka-Munk理论不适合用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分含量代替上式中F与C进行运算。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法29/9229（二）薄层色谱规范化操作1、仪器与材料①薄层板；②涂布器；③点样器材；④展开箱（层析缸）⑤显色与检测仪器2、操作方法①薄层板制备；②点样；③展开；④检测；第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法30/9230第三节惯用定量分析方法（三）定量分析方法1、方法学考查新建薄层扫描定量方法必须进行方法考查，以说明新建方法可靠性，考查内容有工作曲线、定量结果精密度及准确度、统计检验等内容。中药成分测定方法31/9231（1）工作曲线

①检验所选择散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校直为直线，不然，调整SX值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。②考查工作曲线是否过原点，方便确定采取一点法或二点法定量。③确定点样量线性范围。既使采取曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，所以需确定点样量上、下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品峰面积相靠近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采取随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法32/9232第三节惯用定量分析方法（2）精密度考查

取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点5点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（RSD），作为衡量定量分析结果精密度指标。RSD应小于4%。

式中：为n次测量平均值，S为标准差。中药成分测定方法33/9233第三节惯用定量分析方法（3）准确度考查回收率是衡量定量方法准确度指标，惯用加样回收率（R）来衡量，其值应在95-105%之间，测量数据普通为5-6个。将加入纯品试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点峰面积，计算各溶液中组分量，计算回收率（R）。中药成分测定方法34/9234（4）统计检验统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量两组试验数据精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。统计检验包含F检验与t检验。

F检验即精密度差异检验，用以检验两组数据精密度或偶然误差是否存在显著性差异，普通为单侧检验。

t检验即准确度差异检验，用以检验两组测量数据平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证实两种方法测得均值不存在显著性差异时，则新方法能够代替旧方法，t检验普通为双侧检验。t检验与F检验详细方法参见分析化学相关论著，此从略。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法35/9235第三节惯用定量分析方法2、定量方法惯用定量方法有外标法、内标法、追加法（叠加法）及回归曲线定量法。（1）外标法外标法是薄层色谱扫描最惯用定量方法，方法简便，但点样必须准确。①外标一点法工作曲线经过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一个浓度标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=F1·A式中：C为组分重量或浓度，A为测得该组分峰面积，F1为直线斜率或百分比常数。中药成分测定方法36/9236②外标二点法工作曲线不经过原点时，只能用外标二点法定量，最少需点二种不一样浓度标准溶液（或一个浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为：C=F1A+F2式中：C、A同前，F1为直线斜率或百分比常数，F2为纵坐标截距，F1和F2值由仪器自动算出。

外标一点法、二点法只是指用一个或二种浓度标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个；并调整标淮溶液浓度或供试品与标准溶液点样量，使其峰面积相靠近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法37/9237第三节惯用定量分析方法（2）内标法内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量定量方法。

内标物选择要求是：纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，不然内标斑点峰面积将不能代表内标物量。内标物须为样品中所不含有成份。内标物不与其它斑点相重合，分离度合乎要求。为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中浓度应相等。中药成分测定方法38/9238特点：1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。2）不易找到适宜Rf值纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。方法：1）内标一点法：当工作曲线经过原点时采取内标一点法。内标一点法公式：2）工作曲线不经过原点时必须采取内标二点法内标二点法公式：

式中：C、Cis分别为组分及内标物浓度或重量，A、Ais分别为测得组分及内标物峰面积，F1为直线斜率或百分比常数，F2为截距，F1和F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品浓度或重量。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法39/9239（3）回归曲线定量法将不一样浓度（或不一样量）标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描;由计算机对所测得峰面积及对应点样量进行线性或非线性回归;直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量方法;CAMAG系列薄层扫描仪即采取此方法。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法40/9240第三节惯用定量分析方法（四）影响薄层色谱分析主要原因1、样品预处理及供试液制备2、薄层色谱点样技术3、吸附剂活性与相对湿度影响4、溶剂蒸气在薄层色谱中作用5、温度影响中药成分测定方法41/9241相对湿度（%）所需硫酸浓度（V/V）硫酸（ml）水（ml）326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相对湿度用硫酸溶液第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法42/9242第三节惯用定量分析方法四、气相色谱法

气相色谱法是以气体为流动相柱色谱分离分析方法。

特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析功效，适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。

适用范围：适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。中药成分测定方法43/9243第三节惯用定量分析方法（一）基本原理

气相色谱是依据汽化后试样被载气带入色谱柱，因为各组分在两相间作用不一样，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量改变转换成电信号改变统计成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析方法。中药成分测定方法44/9244第三节惯用定量分析方法（二）试验条件选择在气相色谱分析中，为到达满意分离效果，需依据VanDeemeter方程式和分离度方程式选择适当分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件选择。1、固定相选择1）气—液色谱①固定液：按极性相同、化学官能团相同相同性标准和主要差异选择。②载体：普通为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理硅藻土。2）气—固色谱：固定相大多采取高分子多孔微球（GDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。中药成分测定方法45/9245第三节惯用定量分析方法2、柱温选择选择基本标准：在使最难分离组分有符合要求分离度前提下，尽可能采取较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。在实际工作中普通依据样品沸点来选择柱温，详细有以下几点：高沸点样品（沸点300-400℃），采取1-5%低固定液配比，柱温200-250℃。沸点为200-300℃样品，采取5-10%固定液配比，柱温150-180℃。沸点为100-200℃样品，采取10-15%固定液配比，柱温选各组分平均沸点2/3左右。气体等低沸点样品，采取15-25%高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或50℃下进行分析。对于宽沸程样品，需采取程序升温方法进行分析。但需注意是柱温要低于固定液最高使用温度。中药成分测定方法46/92463、载气选择主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度影响三方面考虑。N2是最惯用载气；载气流速较低时，宜用N2；流速高时，宜用H2、He；较长色谱柱，宜用H2作载气；

热导检测器应选取H2、He；氢焰检测器、电子捕捉检测器，普通用N2；普通控制载气流速高于其最正确流速。惯用载气流速为20-80ml/min。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法47/9247第三节惯用定量分析方法4、其它条件选择气化室（进样口）温度：气化温度取决于样品挥发性、沸点范围、稳定性及进样量等原因。检测室温度检测器温度普通需高于柱温，以免色谱柱流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温30℃左右或等于气化室温度。进样量在检测器灵敏度足够前提下，尽可能降低进样量，通常以塔板数下降10%作为最大允许进样量。对于填充柱，气体样品为0.1-1μl，液体样品为0.1-1μl，最大不超出4μl为宜。毛细管柱需用分流器分流进样，分流后进样量为填充柱1/10-1/100。另外，进样速度要快，进样时间要短，注意留针时间和室温影响，以准确控制进样量，以利于分离。中药成分测定方法48/9248第三节惯用定量分析方法5、检测器热导检测器（TCD）：通用型检测器，应用广泛，但灵敏度较低；氢焰离子化检测器（FID）：应用最广泛，适合用于含碳有机物测定，载气多为N2。氮-磷检测器（NPD）：专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量检测。电子捕捉检测器（ECD）：专属性检测器，适合用于痕量电负性有机物—如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物分析。中药成分测定方法49/9249第三节惯用定量分析方法（三）定量分析方法气相色谱惯用定量方法有内标法、外标法、归一化法等。1、内标法特点：为最惯用定量方法优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来定量分析误差；缺点：样品配制较麻烦，有些内标物不易寻找。关键：选择适当内标物。适用范围：①适合用于样品全部组分不能全部流出众谱柱；②检测器不能对每个组分都产生信号；③只需测定样品中某几个组分含量时情况。中药成分测定方法50/9250第三节惯用定量分析方法原理：选择一内标物，将一定量内标物加入到样品中，依据试样重量W和内标物重量Ws及待测组分和内标物峰而积Ai、As，求出待测组分含量。待测组分百分含量为：Ci%=式中fi、fs分别为被测组分和内标重量校正因子。在中药制剂分析时，校正因子经常不知，可采取药典方法测定校正因子再用内标法，或采取内标对比法测定。中药成分测定方法51/9251第三节惯用定量分析方法（3）内标工作曲线法内标工作曲线法与外标法相同，只是在各种浓度标准溶液中加入相同量内标物，进样，以标准物与内标物峰面积比Ai/AS对Ci作工作曲线（或求回归方程）样品测定时也加入等量内标物，依据样品与内标物峰面积比AX/AS由工作曲线求得待测组分含量。中药成分测定方法52/9252第三节惯用定量分析方法2、外标法关键：①进样量准确；②试验条件恒定。分类：1）工作曲线法：用一系列浓度对照品溶液确定工作曲线，在完全相同条件下，准确进样等体积样品溶液，计算其含量；2）外标一点法：当工作曲线截距为零时，可采取外标一点法定量，中药成分测定方法53/92533、归一化法关键：要求全部组分均要产生色谱峰。适用范围：通常只能用于粗略考查供试品杂质含量，普通宜用于微量杂质含量检验.①校正面积归一化法测定各组分含量。②面积归一化法计算：中药成分测定方法54/9254第三节惯用定量分析方法高效液相色谱法（HPLC）是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱理论和试验方法。高压输送流动相，采取高效固定相及在线检测等伎俩发展而来分离分析方法，含有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。

适用范围：适合用于极性、非极性化合物，离子型化合物和高分子化合物分离分析。中药成分测定方法55/9255第三节惯用定量分析方法（一）HPLC基本原理（二）HPLC试验条件选择1、色谱柱选择依据被分离物质化学结构、极性和溶解度等原因进行选择。①大多数药品可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；②也可选取正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；③解离药品可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；④脂溶性药品异构体分离测定可采取硅胶吸附色谱柱。中药成分测定方法56/92562、流动相选择1）反相键合相色谱流动相惯用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药品非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃等用于分离疏水性物质缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特征化合物反相键合相色谱惯用流动相中药成分测定方法57/9257第三节惯用定量分析方法2）正相键合相色谱

①常采取饱和烷烃（如正已烷）中加入一个极性较大溶剂作为极性调整剂（如异丙醚），经过调整极性调整剂浓度改变溶剂强度；

②常采取二元以上混合溶剂系统。中药成分测定方法58/9258第三节惯用定量分析方法3、洗脱方式

等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，使全部组分k值都处于这个范围内，适合用于组分数较少、性质差异不大样品。

梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相组成（如溶剂极性、离子强度和pH值等），适合用于分析组分数多、性质相差较大复杂混合物样品，从而使全部组分都在适宜条件下取得分离。中药成分测定方法59/92594、检测器

检测器特点检测限适用范围紫外检测器（UV或UVD）分为:①可变波长型②二极管阵列检测器①用于检测有外吸收物质;②灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱.10-7-10-12g用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧基化合物等荧光检测器(FD)①用于能产生荧光或其衍生物能发荧光物质;②灵敏度高于紫外检测器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等蒸发光散射检测器(ELSD)①属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相任何样品组分;②检测灵敏度较低,适适用于流动相能挥发色谱洗脱,不能用含缓冲盐流动相用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物中药成分测定方法60/92604、检测器

电化学检测器(ECD)用于能氧化、还原有机物质检测1×10-12g/ml适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等示差折光检测器(RID)①属通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测.②稳定性好,操作方便.③灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动影响大,不适合梯度洗脱10-8g/ml尤其适合于糖类检测化学发光检测器(CLD)①高选择性、高灵敏度新型检测器.②设备简单,本身发光,无需光源,价格廉价Pg级(10-12)用于分析微量脂质、核酸、生物胺等中药成分测定方法61/92615、HPLC前处理（1）流动相处理

①溶剂纯化选择专供色谱分析用“色谱纯”溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析要求。因为不一样色谱柱和检测方法对溶剂要求不一样，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水普通采取石英系统二次蒸馏水。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法62/9262②流动相脱气HPLC所用流动相必须预先除去其中空气，习称脱气，普通在临用前对流动相进行脱气，惯用脱气法有超声波振荡脱气、惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热法。③过滤过滤是为了预防不溶物堵塞流路和色谱柱入口处微孔垫片，所以应预先除去流动相中任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而惯用方法是过滤，采取0.45μm以下微孔滤膜过滤。滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。第三节惯用定量分析方法中药成分测定方法63/9263第三节惯用定量分析方法（2）样品处理HPLC分析前需对样品进行预处理，方便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品形式及所用溶剂符合HPLC要求。①待测组分提取②溶剂挥发(浓缩）③滤过样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中悬浮物或部分大分子杂质。中药成分测定方法64/9264第三节惯用定量分析方法正相色谱:流动相极性小于固定相极性分配色谱法，主要用于极性物质分离测定；反相色谱:流动相极性大于固定相极性分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质分离测定中药成分测定方法65/9265第三节惯用定量分析方法化学键合相是将固定液官能团键合在载体上所形成固定相。含有化学性能稳定，热稳定性好，普通在pH2-8范围溶液中不变质，使用过程不流失，载样量大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。药典中HPLC法所采取固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相色谱法称为化学键合相色谱法.现就中药分析中最惯用键合相色谱法作一介绍。中药成分测定方法66/9266第三节惯用定量分析方法（1）反相键合相色谱法反相键合相色谱法是当代液相色谱中应用最为广泛方法，占整个HPLC应用80%左右。反相色谱法普通采取非极性键合相，十八烷基键合相（简称ODS或C18）是最惯用非极性固定相，对于各种类型化合物都有较强适应能力；流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水互溶极性调整剂，惯用有甲醇-水、乙腈-水系统。极性调整剂性质及其与水混合百分比对溶质保留值和分离选择性有显著影响，流动相极性增大，洗脱能力降低，溶质k增大，tR增大；反之，k与tR减小。调整流动相极性，可控制k值在所要求范围内（k=1-10），对于结构类似组分，极性大组分先出柱。中药成分测定方法67/9267第三节惯用定量分析方法（2）正相键合相色谱法正相键合相色谱法应用不如反相色谱法普及，主要用于分离分析溶于有机溶剂极性及中等极性分子型物质。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）键合相是正相色谱惯用极性键合相，流动相通惯用烷烃（惯用正已烷）加适量极性调整剂组成。

中药成分测定方法68/9268第三节惯用定量分析方法（3）离子对色谱法

直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物方法作为离子对色谱法（PIC或IPC），该法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法，但近年来广泛应用几乎都是反相离子对色谱法，故本书只介绍反相离子对色谱法.①基本原理:以C18或C8键合相为固定相，用含离子对试剂有机溶媒-水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物.②适用范围:适合用于有机酸、碱、盐分离;用离子交换色谱法无法分离离子和非离子混合物分离;在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸分析。

③缺点:离子对试剂价格比较贵.④分离条件选择:离子对试剂性质和浓度、流动相pH值及流动相中所含有机溶剂种类与百分比等。中药成分测定方法69/9269第三节惯用定量分析方法i离子对试剂选择通常所选取离子对试剂电荷应与试样离子电荷相反。离子对试剂主要应用对象1、季铵类（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基铵）强酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺类药品、水溶性维生素）2、叔胺类（如三辛基胺）磺酸盐等3、烷基磺酸盐（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸盐）强碱和弱碱（如儿茶酚胺、罂粟碱、烟酰胺）4、高氯酸各种碱性物质（如有机胺、肽）5、烷基硫酸盐（如辛烷、十二烷基硫酸盐）应用对象同烷基磺酸盐中药成分测定方法70/9270第三节惯用定量分析方法反相离子对色谱法中流动相pH值选择标准样品类型流动相PH值说明1、强酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整个pH范围内，样品可离解，实际pH值选择取决于共存其它组分类型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5样品可离解，其k值取决于离子正确性质样品离解被抑制，其k值取决于未离解样品性质。3、强碱（pKa>8）如季铵类2-8同强酸4、弱碱（pKa<8）如儿茶酚胺6-7.42-5样品离解被抑制，其k值取决于未离解样品性质样品可离解，其k值取决于离子正确性质。ii.流动相pH值控制

中药成分测定方法71/9271第三节惯用定量分析方法iii.有机溶剂选择反相离子对色谱法中，甲醇-水、乙腈-水系统是最惯用流动相，流动相中所含有机溶剂百分比越高，组分k值越小。普通而言，样品组分疏水性及离子对试剂疏水性越强，所需有机溶剂百分比越高。中药成分测定方法72/9272第三节惯用定量分析方法（4）离子抑制色谱法原理:因为离子对试剂价格较贵，对弱酸、弱碱分离，往往采取离子抑制色谱法。经过向流动相加入少许弱酸（惯用醋酸）、弱碱（惯用氨水）或缓冲盐（惯用磷酸盐及醋酸盐），调整流动相pH值，抑制样品组分解离，增加组分在固定相中溶解度，改进峰形，到达分离有机弱酸、弱碱目标，这种技术称为离子抑制色谱法（ISC）。

中药成分测定方法73/9273第三节惯用定量分析方法（4）离子抑制色谱法特点:该方法简便、经济实用、分离效果好，在许多场所可替换离子对色谱法，但重复性较差是其缺点。适用范围:离子抑制色谱法通惯用于反相色谱中，适合用于3.0≤pKa≤7.0弱酸、7.0≤pKa≤8.0弱碱和两性化合物分离，以及它们与分子型化合物共存时分离。中药成分测定方法74/9274第三节惯用定量分析方法离子抑制色谱法与离子对色谱法区分：

①离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂，调整pH值，抑制样品组分解离，使其以分子形式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂，并调整pH值使样品组分尽可能呈解离状态，使离子对试剂反离子与样品离子结合成中性离子对。②离子抑制色谱仅适合用于弱酸、弱碱分离，不适合用于有机强酸、强碱分离；而离子对色谱法对不一样强度酸、碱均适用。中药成分测定方法75/9275第三节惯用定量分析方法（四）定量分析方法HPLC惯用定量方法有:外标法、内标法（内标对比法和内标标准曲线法）内加法。中药成分测定方法76/9276第三节惯用定量分析方法七、荧光分析法

优点:灵敏度高(检测限可达10-10---10-12g/ml）、选择性好、方法快捷，试样量少（几十微克或几十微升）等特点，并可提供较多荧光参数（激发光谱、荧光光谱、荧光强度等）。缺点:其不足之处是干扰原因较多需严格控制试验条件，且含有天然荧光物质数量不多，因而其应用不如可见—紫外光度法广泛。中药成分测定方法77/9277第三节惯用定量分析方法2、测定方法

直接荧光法中药及其制剂中许多物质本身含有荧光，可用荧光法直接测定，但因为中药制剂成份复杂，普通需经适当提取分离后，再进行荧光测定，如白芷中莨菪亭、伞花内酯含量测定。制备荧光衍生物对于没有荧光或荧光很弱物质，可选择适当试剂，使其生成含有特异荧光衍生物，从而扩大荧光分析范围。如包公藤甲素荧光分析。化学引导荧光法利用氧化、还原、水解、缩合、配合和光化学反应等化学方法，使一些本身不能产生荧光物质转变为荧光化合物