第十一讲蛋白质的测定

第十一讲蛋白质的测定第1页，共56页，2023年，2月20日，星期一教学内容了解蛋白质和蛋白质系数、氨基酸和氨基酸态氮的概念，凯氏定氮法原理和方法，氨基酸和氨基酸态氮的测定原理；掌握凯氏定氮法和双指示剂甲醛滴定法、电位滴定法。第2页，共56页，2023年，2月20日，星期一自学引导题1、蛋白质系数是如何计算出来的？2、蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？第3页，共56页，2023年，2月20日，星期一6.1概述(1)蛋白质的生理功能(2)蛋白质含量的测定意义(3)蛋白质的组成及性质(4)蛋白质的测定方法(5)蛋白质系数第4页，共56页，2023年，2月20日，星期一第5页，共56页，2023年，2月20日，星期一2004/4安徽阜阳劣质奶粉致大头娃娃171,13人死头脸胖大，四肢细短，体重比出生时还轻205个奶粉品46个不合格生产厂家的55种奶粉。分布8个省，其中蛋白质含量低于5%的有31种，最少的仅为0.37%，第6页，共56页，2023年，2月20日，星期一（1）蛋白质的生理功能蛋白质是生命的物质基础维持人体的酸碱平衡、水平衡遗传信息的传递物质的代谢及运转都与蛋白质有关。

6.1概述第7页，共56页，2023年，2月20日，星期一

(2)蛋白质含量的测定意义人体重要的营养物质,食品的营养指标。合理开发利用食品资源、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制、提高和监督产品质量。第8页，共56页，2023年，2月20日，星期一蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大。组成：20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来化学元素：C、H、O、N（P、S、Cu、Fe、I）；官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基因、芳香基团结论：含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。(3)蛋白质的组成及性质第9页，共56页，2023年，2月20日，星期一

可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，如含氮、肽键、折射率等；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性或碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，通过测总氮量来确定蛋白质含量。(4)蛋白质的测定方法第10页，共56页，2023年，2月20日，星期一

蛋白质系数：每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同的蛋白质由于氨基酸的构成比例及方式不同，含氮量不同。不同种类的食品的蛋白质系数有所不同。(5)蛋白质系数第11页，共56页，2023年，2月20日，星期一不同产品的蛋白质系数(F)

玉米、鸡蛋、青豆等：6.25

花生：5.46

大米：5.95

大豆及制品：5.71

小麦：5.70

牛乳及制品：6.38第12页，共56页，2023年，2月20日，星期一(1)

原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。从消耗的标准酸计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。常量凯氏定氮法

1、通过学习觊氏定氮法的原理，我们可知道操作分为哪几个大的步骤？2、加入硫酸钾、硫酸铜的作用是什么？自学引导第13页，共56页，2023年，2月20日，星期一

1、消化

反应方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。

浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

第14页，共56页，2023年，2月20日，星期一

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：

2、蒸馏

2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O第15页，共56页，2023年，2月20日，星期一3、吸收

加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O4、滴定

待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3第16页，共56页，2023年，2月20日，星期一第17页，共56页，2023年，2月20日，星期一

准确称取均匀的固体样品0.5～3g,或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。(2)测定方法①

样品消化第18页，共56页，2023年，2月20日，星期一若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。第19页，共56页，2023年，2月20日，星期一注意问题：①加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；②消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；第20页，共56页，2023年，2月20日，星期一③样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；④消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。第21页，共56页，2023年，2月20日，星期一②蒸馏、吸收第22页，共56页，2023年，2月20日，星期一按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。第23页，共56页，2023年，2月20日，星期一注意问题：安装的装置应整齐美观、协调，仪器各部件应在同一平面内平行或垂直。不能漏气。第24页，共56页，2023年，2月20日，星期一要注意控制热源使蒸汽产生稳定，不能时猛时弱，以免吸收液倒吸；蒸馏前加碱量应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。第25页，共56页，2023年，2月20日，星期一3、滴定将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。

注意问题：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。第26页，共56页，2023年，2月20日，星期一（3）试剂消化用：①浓硫酸②硫酸钾③硫酸铜蒸馏用：④40%氢氧化钠溶液第27页，共56页，2023年，2月20日，星期一吸收用：⑤4%硼酸滴定用：⑥0.1000mol/LHCl标准溶液⑦0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂第28页，共56页，2023年，2月20日，星期一硫酸钾的作用

加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O第29页，共56页，2023年，2月20日，星期一硫酸铜的作用

催化作用、指示作用（消化完全指示：蓝绿色；蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀）第30页，共56页，2023年，2月20日，星期一

说明事项：

蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。第31页，共56页，2023年，2月20日，星期一微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。第32页，共56页，2023年，2月20日，星期一6.3氨基酸态氮的测定为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。第33页，共56页，2023年，2月20日，星期一

氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。第34页，共56页，2023年，2月20日，星期一氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法电位滴定法第35页，共56页，2023年，2月20日，星期一6.4.1双指示剂甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而破坏内盐。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。第36页，共56页，2023年，2月20日，星期一（2）操作：用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量再用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量。（3）方法适用范围浅色样品第37页，共56页，2023年，2月20日，星期一(4)操作方法

移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。第38页，共56页，2023年，2月20日，星期一式中

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol

(5)结果计算

氨基酸态氮

（%）第39页，共56页，2023年，2月20日，星期一6.4.2电位滴定法(1)原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的电极插入被测液中，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。(2)仪器酸度计（附磁力搅拦器）；第40页，共56页，2023年，2月20日，星期一(3)试验步骤①样品处理吸取样品液于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述样品液中，用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗的NaOH溶液体积。第41页，共56页，2023年，2月20日，星期一②氨基酸的滴定在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH溶液体积。第42页，共56页，2023年，2月20日，星期一③空白滴定吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积。操作说明：第一次滴定是除去其它游离酸，所消耗的NaOH溶液体积不用于计算。第二步滴定才是测定氨基酸，用消耗的NaOH溶液体积进行计算。第43页，共56页，2023年，2月20日，星期一

（V1-V2）×C×0.014氨基酸态氮%=————————————×100m×20/100V1---酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积mLV2---空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积mLC---NaOH标准溶液的浓度mol/Lm---吸取的酱油的质量g0.014---氮的毫摩尔质量g/mmol（4）结果计算第44页，共56页，2023年，2月20日，星期一作业现抽取南宁酱油厂生产的塑料袋装铁鸟牌酱油1袋（规格500mL）（生产日期20050520），要求测定氨基酸态氮含量。某检验员按密度瓶法测定了该酱油的相对密度为1.128，然后吸取酱油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用pH6.18的标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用0.0498mol/L

NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,消耗的NaOH溶液体积为2.21mL。第45页，共56页，2023年，2月20日，星期一在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,消耗的NaOH溶液体积为9.12mL。吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积为1.36mL。

1、请问在测定过程中为什么要加入中性甲醛？

2、计算该次氨基酸态氮含量测定结果。

3、该检验员按同样的方法另作了4次测定，结果分别为0.49%,0.36%,0.50%,0.52%，请你写一份完整的检验评价报告。第46页，共56页，2023年，2月20日，星期一相关知识点回顾：一、可疑值的取舍

Q检验法：当测定次数较少时,Q检验法是一种常用的简便方法。该法是将测定值按大小顺序排列,由可疑值与其相邻值之差的绝对值除以极差,求得Q值。第47页，共56页，2023年，2月20日，星期一

Q值愈大,表明可疑值离群愈远,当Q值超过一定界限时应舍去可疑值。下表为不同置信度时的Q值。当计算值大于或等于表中值时,该可疑值应舍去,否则应予保留。第48页，共56页，2023年，2月20日，星期一

例如,平行测定盐酸浓度(mol/L),结果为0.1014,0.1021,0.1016,0.1013。试问0.1021在置信度为90%时是否应舍去。第49页，共56页，2023年，2月20日，星期一

查表,当n=4,Q0.90=0.76。因Q<Q0.90,故0.1021不能舍去。当测定次数在3-10次之间时，最好用Q检验法。第50页，共56页，2023年，2月20日，星期一二、对方法相对标准偏差的要求，一般主要取决于被测对象的含量，含量越高要求相对标准偏差越低，例如，大于10%的含量相对标准偏差一般不大于1%，随着含量的降低，相对标准偏差可逐步增加，5%，10%，20%，30%甚至50%。生产工艺有特殊要求的，由技术条件决定。

第51页，共56页，2023年，2月20日，星期一习题讲解：解：1、加入中性甲醛是为了固定氨基酸中的氨基，使羧基显示出酸性，才能进行氨基酸测定。2、依据题意，酱油的相对密度d420=1.128,取样体积V＝5.00mL酱油的质量m＝d420×V＝1.128×5.00＝5.64g第52页，共56页，2023年，2月20日，星期一酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积V1＝9.12mL空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积