关木通致急性肾小管坏死肾间质微血管病变的研究

关木通致急性肾小管坏死肾间质微血管病变的研究

近年来，肾间质微血管病变（ptc）引起的肾间质缺氧化，引起了肾间质纤维进展性影响的关注。以往的研究表明,含马兜铃酸的中药关木通引起的急性肾小管坏死与抗生素所致的急性肾小管坏死有显著区别,其特征为肾小管上皮细胞损伤后呈低再生状态,且在急性中毒性损伤的同时,伴有早期出现并呈快速进展的肾间质纤维化,发生机制尚未完全明确。本研究通过观察关木通致急性肾小管坏死患者肾组织病变中肾间质微血管数目及结构的变化特点,并与抗生素致急性肾小管坏死的病理特点做比较,初步探讨关木通致急性肾小管坏死微血管病变在其进展性肾间质纤维化中的作用及可能发生的机制。对象和方法一、目标1.关木通致急性肝肾损害的诊断标准关木通致急性肾小管坏死组,1997年5月-2001年6月我院肾内科住院患者4例,男3例,女1例,年龄29～43岁。关木通致急性肾小管坏死的诊断标准:(1)有明确关木通中药煎剂(2例)及含关木通成分龙胆泻肝丸(2例)服用史,与发病关系密切;(2)肾穿前无近期或长期抗生素、解热镇痛药等其他可疑肾毒性药物服用史,无全身过敏表现;(3)肾脏病理检查确诊为急性肾小管坏死,并具有急性马兜铃酸肾病的病理特征;(4)临床可除外其他原因导致的急性肾小管坏死。2.年龄及性别分布抗生素致急性肾小管坏死组,同期住院患者5例,男4例,女1例,年龄27～45岁。均经肾活检病理确诊为急性肾小管坏死,曾服用与致病相关的抗生素(氨基糖苷类3例,β-内酰胺类2例),可除外其他中西药物所致肾损害。3.肾活检组织对照组,选5例(男3例,女2例,年龄25～36岁)非IgA型轻度系膜增生性肾小球肾炎患者的肾活检组织,均无明显肾小管间质病变及小动脉病变。4.有糖尿病史(1)年龄>45岁;(2)有高血压病史或高血压家族史;(3)有糖尿病史;(4)其他原发、继发或药物/毒物导致的肾小球和(或)肾小管间质疾病。二、小鼠与马抗小鼠igg1.肾活检前1d测血压及血肌酐(Scr)。2.免疫组化:2μm石蜡切片脱蜡至水,0.5%H2O2甲醇封闭30min,微波抗原修复——枸橼酸盐溶液10min[八因子相关抗原(Ⅷ-Ag),血管内皮生长因子(VEGF)]。以小牛血清白蛋白(含10%山羊血清)或5%脱脂牛奶封闭20min,加入一抗(兔抗人Ⅷ-Ag、小鼠抗人VEGF,购自美国Zymed公司)4℃过夜,次日先后加入二抗(生物素标记的山羊抗兔IgG、马抗小鼠IgG,购自美国VECTOR公司)及三抗(辣根过氧化物酶耦联链卵白素,购自美国VECTOR公司)37℃各孵育30min,DAB显色,苏木素复染,过梯度酒精,中性树脂封片。以PBS和正常非免疫兔或小鼠血清代替一抗作阴性对照。3.试验结果采用单盲法评价:(1)肾内毛细血管计数:每张切片选肾皮质内10个不含肾小球的高倍视野(×400,0.065mm2),计数肾间质内Ⅷ-Ag阳性的毛细血管腔个数,计算PTC密度(Ⅷ-Ag阳性的毛细血管腔个数/mm2)。每张切片计数10～15个肾小球横切面上Ⅷ-Ag阳性的毛细血管腔个数,计算肾小球毛细血管密度(Ⅷ-Ag阳性的毛细血管腔个数/肾小球横切面)。(2)VEGF表达:每张切片计数200个肾小管,计算VEGF阳性的肾小管百分率。4.病理观察指标的判定及肾小管和肾间质病变程度的确定:石蜡切片分别行HE、Masson、Masson加六胺银染色。根据光镜确定肾小管和肾间质病变程度(每张切片肾小球>10个),以肾小管上皮细胞变性、坏死、细胞脱落、细胞再生、肾间质炎性细胞浸润作为评价肾小管和肾间质损伤指标,并进行半定量分析,在全部肾活检组织内病变面积<25%为1级,25%～50%为2级,50%～75%为3级,>75%为4级。肾小管损伤指数(TI)为肾小管上皮细胞变性、坏死、细胞脱落病变分级之和。同时观察肾小球病变、肾间质炎性细胞浸润和小动脉病变情况。5.透射电镜下观察肾间质微血管内皮细胞基底膜及结构。三、非正态分布数据应用SPSS10.0统计软件。计量资料以均数±标准差表示,非正态分布数据以中位数(M)和(或)范围表示。各组间比较行方差分析,非正态分布数据采用秩和检验。各指标之间行Pearson相关及等级相关分析。结果一、3病理组织学检测患者Scr水平相对较低,但与B组比较未达统计学意义。光镜及半定量分析显示,A组肾小管上皮细胞呈多灶或弥漫性裸基底膜样坏死,细胞再生不良。A、B组患者的肾间质水肿明显,但炎性细胞浸润均不显著,光镜下均未见肾间质纤维化,亦无肾小球缺血性皱缩或肾小动脉管壁增厚等现象。二、3肾间质微血管数目见表2,3组患者肾小球血管袢密度及形态基本一致,无明显异常。C组肾间质微血管较为密集,均匀分布于肾小管周围。B组肾间质微血管数目较C组有所减少。A组肾间质微血管数目明显减少,与B、C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。三、3组患者肾间质微血管及内皮细胞形态结构的比较,见表3光镜下,C组肾间质微血管的管腔完整、形态规则,呈圆形或椭圆形(图1)。B组肾间质微血管的管腔明显扩张且形态不规则,但血管壁仍完整(图2)。A组肾间质微血管普遍出现管腔扩张变形或呈明显缩小改变,血管壁可见明显的断裂、破损现象(图3)。电镜下,3组患者肾小球血管袢的内皮细胞形态结构基本一致,无明显改变,肾小球基底膜未见皱缩现象。PTC内皮细胞核均无明显改变,未见凋亡迹象。C组肾间质微血管开放良好,内皮细胞呈扁平单层结构,胞质均匀,与基底膜连接紧密,基底膜呈均质结构,厚度均一(图4)。B组肾间质微血管管腔扩张明显,内皮细胞与基底膜结构完整(图5)。A组肾间质微血管除管腔扩张外,内皮细胞下间隙明显增宽,其内可见变性的细胞器及颗粒状结构(图6A),内皮细胞胞质增宽、线粒体肿胀(图6B),内皮细胞下间隙明显增宽,可见变性的细胞器及颗粒状结构,部分内皮细胞与基底膜分离、断裂,并可见内皮细胞脱落至腔内(图6C),基底膜结构不规整,可见节段性增厚伴有分层(图6D),局部有断裂现象(图6E)。四、c组不同浓度阳性表达率表1C组肾小管上皮偶有VEGF表达(图7),阳性表达率为2.1%(0～3.86%)。B组肾小管上皮细胞VEGF表达显著增加(图8),阳性表达率为42.5%(31.33%～60.25%),是C组的20.2倍(P<0.001)。A组肾小管上皮VEGF表达也有增高(图9),阳性表达率为23.1(18.2～39.5),是C组的9.4倍(χ2=6.1～6.818,P<0.05),但其增高程度明显低于B组(χ2=4.086,P<0.05)。五、ptc密度、肝肾vegf表达与肝肾上皮细胞再生之间的相关性分析见表1A、B组肾间质内PTC密度与肾小管上皮细胞VEGF表达呈正相关(均r=0.793,P<0.05),PTC密度、肾小管VEGF表达与肾小管上皮细胞再生呈正相关(r分别为0.880、0.802,P值均小于0.01)。肾间质微血管ptc的变化情况近年来,含马兜铃酸中药致肾小管间质肾病(AAN)的临床病理特征已广为报道。国内学者依据AAN的临床病理学特点将AAN分为急性AAN与慢性AAN两大类(另有肾小管功能障碍型AAN,较少见),并认为此两种AAN可能各自具有不同的致病机制及不同的临床转归。临床所见的急性与慢性AAN可能是AAN自然病程中不同阶段的特征性表现。明确急性AAN病变早期慢性化的机制是逆转疾病不良预后的关键。国外学者报告,肾间质微血管病变、即PTC丢失造成的肾小管间质缺氧性损伤是进展性肾间质纤维化的重要病因之一。既往研究发现,慢性AAN普遍具有不同程度的肾小球毛细血管袢缺血性皱缩、小动脉管壁增厚和管腔狭窄,少数患者肾小管间质病变呈条带状节段性分布,提示存在药物直接或间接导致血管病变的可能性。本研究结果显示,肾间质的微血管在关木通致急性肾小管坏死(A组)与抗生素致急性肾小管坏死(B组)中均有明显改变并各有异同,共同之处是肾间质内PTC数目减少、管腔扩张变形;B组程度较轻,且PTC的内皮细胞与基底膜结构完全正常,其PTC密度的轻度减低可能与肾间质水肿有关,而管腔扩张可能反映了肾小管损伤后微循环血流量增加以促进肾小管上皮的再生修复;A组肾间质微血管的上述病变尤为明显,其PTC密度仅为B组的一半,而光镜下所见肾间质水肿程度与B组相比无明显差别,提示A组PTC数目确实发生了减少。此外,A组肾间质内PTC除管腔扩张变形外,还可见血管壁断裂,且电镜下发现其内皮细胞肿胀、胞质内出现空泡及性质不明的致密粗颗粒,细胞局部与基底膜有分离现象,并可见基底膜皱缩、增厚呈多层状,提示内皮细胞损伤后可能有物质渗出导致基底膜发生反应性增厚,细胞易于脱落。上述结果表明,A组肾间质内的PTC发生了细胞损伤与结构破坏,并导致微血管数目减少,PTC的病变可直接导致肾小管间质的缺氧状态,从而使A组肾小管间质的损伤进一步加重并呈持续性慢性化进展。本研究在病例选择上除外了高龄、糖尿病、高血压等对血管和内皮影响的因素。2组肾间质内均未见明显的纤维化和细胞浸润,肾小动脉无增厚且肾小球毛细血管袢没有缺血性改变,因此A组的现象提示PTC病变为原发性损伤。此外对肾小球毛细血管袢的观察显示,A、B组毛细血管袢数目及形态与对照组相比均无明显异常或变化,提示关木通中的马兜铃酸成分对肾小球毛细血管可能并无直接损伤。由于AAN病变慢性化时肾间质的纤维化组织可挤压周围血管或合并高血压而导致继发性血管损伤,因此,以往观察到的肾小动脉及肾小球的缺血性改变可能是肾间质纤维化的共同表现而非AAN所特有,这些缺血性改变可能主要与AAN的慢性纤维化有关。含马兜铃酸的中药关木通对肾间质微血管选择性损伤的作用机制目前尚不清楚。根据现有理论推测:一方面可能马兜铃酸或其代谢产物在肾小管间质局部浓缩后,对血管内皮细胞产生直接毒性;另一方面,肾小管损伤后肾间质微环境内细胞因子的改变可能也参与PTC的损伤过程。有研究显示,肾小管上皮细胞VEGF的表达是维持PTC正常功能与结构的重