adfcofilin家族的生物信息学分析

adfcofilin家族的生物信息学分析

细胞骨架中的肌动蛋白参与了许多重要的生理活动，如肌肉收缩、细胞环流、细胞运动、细胞分离等。这些过程的发生除了需要肌动蛋白以外,还需要一些与之结合的调节蛋白参与,现在已经发现了100多种肌动蛋白结合蛋白,其中有一类分子量为15-20KD的蛋白,如肌动蛋白解聚因子(actindepolymerizingfactor,ADF)、cofilin、profilin、actophorin、depactin、destrin、UNC-60等,在一定条件下可以使肌动蛋白微丝解聚,统称为ADF/cofilin分子家族。一、adf在生物细胞和细胞内不同组织分布及分布特点ADF/cofilin分子家族在哺乳类、鸟类、两栖类、昆虫、棘皮动物、原生动物和植物等生物的细胞内广泛存在,其中cofilin广泛分布于从酵母到哺乳类的生物体内,而destrin主要集中分布在鸟类和哺乳类的个体中。ADF/cofilin分子家族的存在是与其功能密切相关的,每一种分子根据其功能的需要,在个体的不同组织、细胞以及细胞内部不同部位的分布都有一定程度的差异。ADF位于许多脊椎动物组织中,在神经元细胞中尤为丰富。在百合和油菜的花丝中检测到特异表达的ADF(分别称为LMP131A和BMP1),而在花瓣、心皮、花芽、叶片和根中则检测不到。变形虫中的actophorin与肌动蛋白一起主要分布于胞质皮层中,特别是在运动细胞的前缘。ADF/cofilin分子家族在生物个体的不同发育阶段,其分布和含量也有一定的差异。鸟类的ADF,亦存在于鸡胚和绝大多数成熟组织中,占总蛋白的0.1%-0.4%,而成熟心脏和骨骼肌中含量不到0.02%,当受精卵发育到11天时,骨骼肌中ADF的量达到最大值,孵出14天后降低到成年水平。玉米中的ADF分子ZmABP1和ZmABP2在花粉粒和萌发的花粉管中特异表达,而ZmABP3在这个时期检测不到,可能在这一特定的发育阶段,ZmABP1和ZmABP2受到某种信号的调节而表达。但在大鼠小脑的整个发育过程中,ADF的量始终保持恒定,且主要位于Purkinje细胞中。二、adfcofili分子家族对肌肉和蛋白岩的影响1.adf与g-actin的结合ADF/cofilin分子家族在一定条件下可以与G-actin、F-actin相结合,形成1:1的ADF-actin复合物,但对结合了ATP、ADP、AMPPNP等核苷酸的G-actin和F-actin的亲和力不同。其中人的ADF与G-actin结合形成的复合物的解离常数为0.2μmol/L,源于鸡胚脑细胞中的ADF在体外与G-actin-ATP和G-actinAMPPNP结合形成的复合物的解离常数是0.1-0.2μmol/L,而与G-actin-ADP结合形成的复合物的解离常数为1.3μmol/L。在生理离子条件和pH7.8时,拟南芥ADF1结合G-actin-ADP或F-actin的量是ATP或ADP-Pi结合形式的两倍,表明ADF能够优先与actinADP相结合。变形虫的actophorin与变形虫和兔骨骼肌的G-actin的亲和力相同,但对兔F-actin的亲和力是对变形虫F-actin的亲和力的10倍。1997年Jiang等用玉米ZmADF3的两个突变体进行实验,ZmADF3-1为分别用Phe和Gly替换ADF3中Tyr103和Ala104的突变体,结果与G-actin和F-actin的结合能力均减弱;ZmADF3-2为用Phe替换ADF3中Tyr67和Tyr70的突变体,结果对G-actin的亲和力与ADF3相似,但不与F-actin相结合,表明ADF与G-actin和F-actin的结合部位不同。在一定条件下,ADF/cofilin可以促使肌动蛋白微丝解聚。例如人的ADF、鸟的ADF、cofilin、猪的destrin、变形虫的actophorin以及棘皮动物的depactin等在较高的pH值条件下,都可以促使微丝解聚。但是,不同来源的ADF/cofilin和肌动蛋白之间的作用也不相同。如尽管秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegan)的肌动蛋白和兔骨骼肌的肌动蛋白的生化特性相同,UNC-60对C.elegan的微丝具有明显的解聚活性,而对兔骨骼肌的微丝无明显作用有人认为ADF/cofilin是通过隔离肌动蛋白单体促使微丝解聚的,Charlier等则认为是通过改变G-actin的临界浓度来实现的,而McGough等的研究证明cofilin可能是通过增加微丝之间的扭曲程度,从而促使微丝解聚的,这方面的机理还有待进一步的深入探讨。另外值得一提的是,ADF/cofilin不只具有结合肌动蛋白和解聚微丝的活性,改变条件,它们也能促使微丝聚合。2.adf信号分子调节细胞磷酸化ADF/cofilin对肌动蛋白的作用是受多方面因素影响的,但通常它们都受pH的调节。人的ADF在pH<7.0时,与F-actin结合,在pH>7.5时,仅与G-actin结合。鸡的ADF在pH6.5-7.1时与F-actin共沉淀,仅有微弱的解聚活性;在pH7.1-7.9时解聚活性增强,而结合F-actin的活性减弱;在pH8.0时以化学计量的方式解聚微丝,形成1:1的ADF-G-actin复合物,此时ADF也可以隔离G-actin,阻止肌动蛋白的聚合。pH对该类分子的影响表现为低pH值时与F-actin结合,pH值升高,解聚活性增强,与F-actin的结合能力减弱,而与G-actin的结合能力增强。但变形虫的actophorin对肌动蛋白的作用却不受pH值的影响,它在各种pH条件下与鸡的ADF在pH6.5时结合F-actin的形式相似。ADF/cofilin的活性还受细胞内外信号分子以及自身磷酸化的调节。ADF有两种形式,磷酸化的ADF(pADF)不结合G-actin,也不使微丝解聚,在体外用碱性磷酸酶去除磷酸基团可以恢复它的解聚活性。在HeLa细胞中导入ADF的突变体cDNA,使Thr25、Ser24突变或被替换,ADF表达且能被磷酸化;而Ser3被剔除或是被Ala或Glu替换,ADF表达但不能被磷酸化,表明Ser3(成熟肽的Ser2)为HeLa细胞的ADF分子中唯一的磷酸化位点。Smertonko等用同样的方法证明Ser6为玉米中ZmADF唯一的磷酸化位点。Morgan等在体外实验中,用任选的4种蛋白激酶一依赖于Ca2+/CaM的蛋白激酶Ⅱ(CaMkinaseⅡ)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)—对源于鸡胚脑的ADF进行磷酸化实验,发现CaMkinaseⅡ具有微弱的磷酸化活性,而PKA、PKC和MLCK都不能使ADF磷酸化,推测体内有更加特异的蛋白激酶的作用。在HT4和皮层神经元细胞中Ca2+浓度和cAMP浓度的升高可以使pADF快速去磷酸化,Ca2+是通过激活蛋白磷脂酶2B(PP2B)使pADF去磷酸化的;cAMP则通过激活蛋白磷脂酶1(PP1)来实现。用cAMP处理培养的星形胶质细胞,15分钟后引起肌动蛋白骨架的破裂。表皮生长因子(NGF)、胰岛素、促肾上腺素(TSH)等也能导致pADF的快速去磷酸化,生长因子对ADF/cofilin分子具有磷酸化和去磷酸化的双重作用。10%的DMSO、dBcAMP、ML-9等处理也可以降低ADF的磷酸化水平,引起微丝的重排。所有这些因子可能都是通过细胞内的信号途径,即信号分子通过细胞内部的第二信使,调节蛋白激酶/磷脂酶的活性,使ADF磷酸化或pADF去磷酸化,实现对细胞内肌动蛋白骨架的精细调节。一些位于较高等生物体内的ADF/cofilin分子,如脊椎动物的ADF、cofilin、destrin、玉米的ADF3、棘皮动物的depactin等,含有类似SV-40大T抗原的兼性结构(KKRKK),在受到细胞内外信号刺激时,可以与肌动蛋白一起从细胞质转入细胞核中。用热激或DMSO处理培养的细胞,ADF和coilin便与肌动蛋白一起从胞质转移到核中,形成棒状结构。热激和DMSO处理可能触发了ADF与肌动蛋白的反应,肌球蛋白可能也参与这一过程。由于热激或DMSO处理能够引起动植物细胞的凋亡,推测细胞内的ADF/cofilin分子家族也参与了细胞的凋亡过程。而在一些较低等生物的ADF/cofilin分子中,如变形虫的actophorin、弓形虫的ADF等,却不具有这一核定位结构。3.profiren和adf的作用ADF/cofilin分子对肌动蛋白的作用还表现为一定的协同性。如脊椎动物的ADF和变形虫的actophorin能够协同结合F-actin。实验证明,profilin与ADF协同作用可以促使微丝踏车(treadmilling)的速度比在纯肌动蛋白溶液中高125倍,profilin和ADF可能是在微丝纤丝的两端以互补的方式促进这一踏车过程的。在pH6.0-8.0时,UNC-60A可以解聚微丝,但不再与F-actin结合;而UNC-60B可以结合F-actin,但却不能使微丝解聚,表现为相互补充的效应。但是,变形虫中的actophorin与来源于兔骨骼肌的F-actin之间结合表现为协同性,而与自身来源的F-actin之间的结合和分离表现为简单的双分子反应。此外,ADF/cofilin分子家族对肌动蛋白的作用也可以被另外一些肌动蛋白的结合蛋白所调节,如原肌球蛋白结合F-actin以后可以防止微丝被ADF解聚;在25℃时,以8.4/1.0的摩尔比结合形成的肌动蛋白-肌球蛋白复合物,可以保护58%的微丝在3小时内不被过量的ADF解聚。这将有利于有机体细胞在一定条件下,保持相对的平衡和稳定。三、adf与cofirenc分子的组成及序列分析ADF/cofilin家族的各个分子的大小和氨基酸序列虽然不尽相同,但却具有很大程度的相似性。人类ADF分子的cDNA有1452bp,编码的ADF分子具有165个氨基酸残基,分子量为19KD,该分子100%同源于猪的destrin,95%同源于鸡的ADF,70%同源于猪和鼠的cofilin,但与actophorin仅有28%的序列相似。鸡胚ADF具有165个氨基酸残基,70%同源于鸡和哺乳类的cofilin;鸡胚cofilin具有166个氨基酸残基,80%同源于猪脑的cofilin。蟾蜍的ADF具有168个氨基酸残基,分别与鸡的ADF和cofilin有66%、77%的序列同源性。玉米中的ZmABP3分子量为17KD,与ZmABP1和ZmABP2分别有56%和58%的同源性。而弓形虫的ADF仅有118个氨基酸残基,分子量为13.4KD,仅由单一拷贝基因编码。在ADF/cofilin分子家族的N端和C端具有与肌动蛋白结合的部位。在N端,人ADF、鸡ADF、猪destrin中为M1A2S3G4V5Q6V7A8D9,在鸡cofilin中为M1A2S3G4V5T6V7N8D9,酵母的cofilin为M1S2R3S1G5V6A7V8A9D10;在C端,人ADF和猪destrin为W104A105P106E107L108A109P110L111K112S113K114M115,酵母的cofilin为W104S105P106D107T108A109P110V111R112S113K114M115,棘皮动物的depactin为W104S105M106E107T108A109N110I111K112L113K114M115。Yonezawa等用模拟cofilinC端结合肌动蛋白位点的人工合成十二肽实验,发现它可以抑制肌动蛋白与cofilin的结合,进一步证明这一序列为ADF/cofilin与肌动蛋白结合和促使微丝解聚的必需序列。可以看出无论是与肌动蛋白的结合部位还是分子的全序列,都是高度保守的,这种保守性表现为物种间的亲缘关系越近,分子间的相似程度越高。正是这种结构上的保守性,保证ADF分子对肌动蛋白的调节功能。四、adf/cofili分子家族对肌动蛋白的作用由于肌动蛋白骨架参与了细胞内一系列的生理活动,而ADF/cofilin分子家族可以直接作用于肌动蛋白,必然对这些生理活动也有重要影响。1.肌动蛋白网的形成和扩大细胞移动的速度粘菌中cofilin过量表达至正常细胞水平的两倍,在细胞内形成肌动蛋白网,细胞皱褶明显,细胞移动的速度也相应增加两倍。这与离体条件下,在稀释的血小板抽提物中加入过量的ADF1后,引起微丝踏车速度加快的结果相似。2.胞质的改变和网的横向流动将在细菌中表达重组的玉米ZmADF1注入鸭跖草雄蕊毛细胞中,起初细胞内所有的胞质环流均停止,中心横越液泡的微丝束被破坏,20-45分钟后,环流恢复,但在胞质皮层中呈明显的横向流动,用荧光标记的罗丹明检测,发现纵向的肌动蛋白网已被横向的射线所替代,这与新的环流方式相一致。3.filiin—神经元的生长将35S标记的Met注入鸡腰椎脊髓的坐骨神经中,间隔20天检测,发现肌动蛋白与其结合蛋白ADF、cofilin、profilin—起沿着轴突转移,且转移的速度相同,其方式可能是ADF、cofilin、profilin与肌动蛋白结合形成复合物一起缓慢移动。在这个过程中,ADF和pADF的活性没有明显的变化,可能在整个过程中,失活与再激活的ADF连续存在,以促使G-actin与F-actin的交换。4.基因zmabp1和zmabp2表达在花粉进入休眠和花粉管萌发的激活过程中,均需要肌动蛋白骨架的重排。玉米基因ZmABP1和ZmABP2在花粉粒及萌发的花粉管中特异表达,但是ZmABP3在这个时期检测不到,可能在这一特定的发育阶段,ZmABP1和ZmABP2受到特定信号的刺激而表达,并进一步参与调节肌动蛋白的重排过程。5.xenopusadf/cofiren抗体对体外生长的影响cofilin位于许多哺乳动物细胞和早期爪蟾胚的卵裂沟中。无论抑制肌动蛋白聚合或是抑制肌动蛋白解聚的试剂均可阻断胞质分裂。在爪蟾二细胞胚阶段,在其中一个细胞中注入XAC(XenopusADF/cofilin)抗体,可以抑制XAC的活性,该细胞