基因诊断和基因治疗

关于基因诊断和基因治疗概念：

基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。

将基因或其组成部分发生异常的疾病统称为基因病。第2页,共73页，2024年2月25日，星期天基因病分为三大类：一、单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。如：血友病、地中海贫血等。二、多基因病：由多个基因突变综合作用引起的疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等、三、获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。第3页,共73页，2024年2月25日，星期天第一节基因诊断（DNAdiagnosis）一、基因诊断的概念和基本概况临床诊断生化学诊断免疫学诊断临床疾病诊断四种方式：以疾病表型改变为依据。（细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）基因诊断对患者基因直接分析第4页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断定义（概念）：

基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法比较有其特点：第5页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断的特点：1、病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如:确定有遗传家族史的人携带致病基因。2、特异性强、灵敏度高：选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。3、稳定性高4、诊断范围广，适应性强目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。（与以疾病表型改变为依据的诊断技术相比）第6页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断的基本概况：伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。DNA双螺旋遗传密码破译DNA重组癌基因与抑癌基因研究地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发

PCR、分子杂交等一系列技术发展第7页,共73页，2024年2月25日，星期天二、基因诊断的对象1、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。2、先天遗传性疾病遗传性疾病:发病的原因为特定基因的突变。第8页,共73页，2024年2月25日，星期天肿瘤的发生：

发病机理尚不请。

初步认为是个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突变引起的疾病二、基因诊断的对象第9页,共73页，2024年2月25日，星期天

（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研究，可同时检出具有高度多态性位点。（2）用southern杂交得到DNA指纹图谱个体识别、亲子鉴定、法医物证4、其他二、基因诊断的对象遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。第10页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断的基本策略：1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因

这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、

地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。第11页,共73页，2024年2月25日，星期天2、检测与某种遗传标志连锁的致病基因遗传连锁－－同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传称连锁。染色体遗传连锁图－－用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。定位性克隆－－根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。第12页,共73页，2024年2月25日，星期天3、检测表型克隆基因针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。表型克隆技术－－是将有关表型与基因结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的影响。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷第13页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断的基本步骤：1、获得待检样品：提取核酸（PCR提高灵敏度)2、制备和标记核酸探针3、基因检测分析第14页,共73页，2024年2月25日，星期天三、基因诊断的常用技术核酸分子杂交聚合酶链反应（PCR）限制性片段长度多态性（RELP）扩增片段长度多态性（AFLP）等位基因特异的寡核苷酸（ASO）单链构象多态性（SSCP）基因芯片第15页,共73页，2024年2月25日，星期天1、核酸分子杂交原理：利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或RNA定性定量分析。基因检验的两个必要条件：1、必需的特异探针（标记的）2、必需的基因组DNA第16页,共73页，2024年2月25日，星期天核酸分子杂交－－核酸印迹杂交DNA印迹杂交（Southernblot）RNA印迹杂交（Nouthernblot）斑点印迹杂交（Dot-blot）原位杂交(situhybridization)第17页,共73页，2024年2月25日，星期天核酸印迹杂交基本过程：提取DNA或RNA→酶切→凝胶电泳→胶变

性处理（DNA）→转印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用变性胶电泳，转膜）1、制备样品：第18页,共73页，2024年2月25日，星期天核酸印迹杂交基本过程：（2）制备探针：探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对原则而结合的核酸分子片段。探针需要标记可直接检测的元素或分子。

如：同位素、荧光、生物素等第19页,共73页，2024年2月25日，星期天核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子（4）检测：方法依标记的探针而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*荧光素（3）杂交：预杂交－－封闭非特异性结合位点杂交－－探针与核酸分子结合第20页,共73页，2024年2月25日，星期天核酸印迹杂交基本过程：第21页,共73页，2024年2月25日，星期天2、聚合酶链反应（PCR)原理：以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下，按半保留复制机制延模板链延伸，快速、特异地扩增特定的DNA。一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。（无细胞分子克隆技术）。第22页,共73页，2024年2月25日，星期天耐高温DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是PCR

成功的关键。PCR的基本过程：（循环程序）变性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水栖高温菌，最适反应温度为72℃，且经90℃以上加温后仍可在温度恢复后复性。第23页,共73页，2024年2月25日，星期天（呈2n扩增速度）PCR基本过程和原理特点：特异性强灵敏度高样品可以是：毛发、血痕单细胞、病原体、肿瘤残留物、犯罪现场遗留物第24页,共73页，2024年2月25日，星期天基因诊断中常用的PCR技术：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。以总RNA或mRNA为模板，逆转录为cDNA后扩增。用于检测特定基因表达水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。第25页,共73页，2024年2月25日，星期天（4）、多重PCR：指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA序列上不同序列片段的一种PCR技术。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。（6）、实时定量PCR：借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测PCR扩增的DNA量的变化。第26页,共73页，2024年2月25日，星期天其他重要的PCR衍生技术反向PCR（IPCR）标记引物PCR（labelledprimersPCR）锚定PCR（anchoredPCR）差异展示PCR（DD-PCR）（见书“分子生物学技术”章节）第27页,共73页，2024年2月25日，星期天3、限制性片段长度多态性（RFLP）检出方法：Southern印迹概念：用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的DNA片段差异，称限制性片段长度多态性（RFLP）。人类基因组中由中性突变导致个体间核苷酸的差异称－－DNA多态性第28页,共73页，2024年2月25日，星期天RFLP类型：2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和重排导致DNA顺序的变化，因而酶切片段改变－－－序列多态性。1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化－－－点多态性致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于连锁分析的基因诊断。第29页,共73页，2024年2月25日，星期天（四）扩增片段长度多态性（AFLP）

应用于基因突变性质不明的连锁分析。AFLP－－串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增,经限制性内切酶酶切后电泳,产生显示扩增片段多态性。第30页,共73页，2024年2月25日，星期天AFLP原理：首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。PCR扩增产物即等位片段之间差别只有几个bp。第31页,共73页，2024年2月25日，星期天5、等位基因特异的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成两种探针：①已知突变位点的核苷酸序列（M）

②正常基因碱基序列（N）2、杂交实验结果：M+N-受检者是突变基因的纯合子M-N+受检者是不存在突变基因M-N-受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型M+N+受检者是突变基因的杂合子原理：

已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者DNA杂交诊断。（可与PCR联用：PCR-ASO）第32页,共73页，2024年2月25日，星期天6、单链构象多态性（SSCP）日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.PCR-SSCP第33页,共73页，2024年2月25日，星期天PCR-SSCP基本过程①PCR扩增靶DNA②将特异的PCR扩增产物变性后快速复性;③将单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.第34页,共73页，2024年2月25日，星期天7、基因芯片

将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基本原理：（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）第35页,共73页，2024年2月25日，星期天基因芯片技术：第36页,共73页，2024年2月25日，星期天目的：检测外源性基因的侵入目标：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生虫、4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝杆菌）5、实验室培养的病原体（克立氏体）四、基因诊断的临床应用:1、在感染性疾病检测中应用第37页,共73页，2024年2月25日，星期天艾滋病与HIV病毒艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。HIV感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。第38页,共73页，2024年2月25日，星期天艾滋病与HIV病毒检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的设计：应在保守区（基因：pol,env,gag,tat)病毒特点：HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k/RNA，主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较之复杂，故称复杂反转录病毒HIV属反转录病毒－－－即单链RNA反转录成双链DNA，进入宿主细胞染色体。第39页,共73页，2024年2月25日，星期天非典型性肺炎（SARS）由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。诊断依靠：流行病学、临床表现、放射诊断、血清学（荧光免疫、ELISA）PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少（关键是引物的合成）第40页,共73页，2024年2月25日，星期天2、在遗传病检测中的应用

产前诊断检测妊娠8－12周的绒毛DNA或羊水细胞

PCR诊断一系列遗传疾病镰刀状细胞贫血的诊断方法：－RFLP诊断

MstⅡ酶切识别序列：CCTNAGG切割正常β链序列：CCTGAGG不切割突变序列：CCTGTGG

－ASO探针诊断第41页,共73页，2024年2月25日，星期天3、在肿瘤检测中的应用原癌基因生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的癌基因抑癌基因一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细胞转化。两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。第42页,共73页，2024年2月25日，星期天癌基因激活变化及检测：1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基因的扩增。检测方法：Southern杂交定量PCR2、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非

DNA水平的过量表达。检测方法：Northern杂交RT-PCR3、点突变：检测方法为各种基于PCR的方法。第43页,共73页，2024年2月25日，星期天抑癌基因的检测：SouthernPCR大片段的缺失、和点突变*两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检出两个等位抑癌基因。方法：RFLP结合PCR，进行缺失检测

点突变主要采用PCR第44页,共73页，2024年2月25日，星期天肿瘤标志物：指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产生的物质。（1）酶类肿瘤标志物（2）激素类标志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白标志物（5）糖蛋白类抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基转移酶（8）多胺免疫组化筛选提高检出率第45页,共73页，2024年2月25日，星期天法医学鉴定针对人类DNA遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。常用技术:DNA指纹分析（VNTR）短串联重复序列（STR）遗传特征分析PCR-扩增片段长度多态性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技术根据可变串联重复序列（小卫星DNA）多态性

高度的个体特异性第46页,共73页，2024年2月25日，星期天DNA指纹（图谱）分析：⑴、选择核心序列作探针，选在核心序列上无切割位点的限制性内切酶，酶解样品，Southernblot得到DNA指纹图谱。针对可变串联重复序列（VNTR）（VNTR是判断个体的遗传标志）⑵、针对VNTR侧翼保守区序列设计探针，用PCR

对该区扩增，电泳得到个体之间长度不同的条带图谱。（VNTR片段较长PCR不易扩增）。第47页,共73页，2024年2月25日，星期天第二节基因治疗（genetherapuy)概念：

将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。概念的扩展：凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的的方法，都可称为基因治疗。第48页,共73页，2024年2月25日，星期天基因治疗策略:总原则：－－直接补替缺陷基因－－抑制非正常基因产物表达－－间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。－－利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤第49页,共73页，2024年2月25日，星期天1、基因矫正－－将致病基因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。2、基因置换－－用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常3、基因增补－－将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。4、基因失活－－利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因的表达。5、免疫调节－－将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。基因治疗的策略：第50页,共73页，2024年2月25日，星期天6、调节性基因治疗：导入编码调控蛋白的基因，治疗基因表答异常的疾病7、化疗保护性基因治疗：导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头”，“弹头”部分是分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗第51页,共73页，2024年2月25日，星期天基因治疗基本程序;方法：1、体外法（exvivo):2、体内法

(invivo):将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择系统，将重组的受体细胞回输患者体内，以改善症状。（普遍采用）直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。基本程序：选择目的基因选择基因载体选择靶细胞基因转移外源基因表达及检测回输体内第52页,共73页，2024年2月25日，星期天治疗基因的来源：1、野生型基因：

单基因缺陷遗传病基因

反义核酸封闭活化的原癌基因

转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤2、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异基因。1、选择治疗的目的基因第53页,共73页，2024年2月25日，星期天用于基因治疗的基因应满足以下条件：（1）体内仅少量表达就可显著改善症状。（2）该基因的过量表达不会对机体造成危害、（3）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要作用，并且该序列是特异的。第54页,共73页，2024年2月25日，星期天理想的载体具有以下特征：1、容易生产

商业化生产，广泛应用，易运输，易保存2、持续表达

一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产物，或能通过某种方法精细调节其表达。3、弱免疫源

转入后不应引起免疫反应。4、组织靶向性

定向输入某种细胞。5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式存在于细胞核内。7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞2、选择基因载体：第55页,共73页，2024年2月25日，星期天基因载体：非病毒载体（裸DNA、脂质体）

病毒载体

（反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）分类：优点：大量生产，毒性小，低免疫性缺点：效率低。优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解，

RNA病毒能整合到宿主染色体，表达水平高等。第56页,共73页，2024年2月25日，星期天病毒介导的基因转移1、逆转录病毒：正链RNA病毒第57页,共73页，2024年2月25日，星期天逆转录病毒结构:基因组组成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每个单链RNA含6个区：5’-LTR（长末端重复序列）

Ψ+（组装所需的非编码序列）gag（编码衣壳结构蛋白基因）pol（编码反转录酶基因）env（编码外壳蛋白基因）3’-LTR第58页,共73页，2024年2月25日，星期天逆转录病毒生活周期:1、感染靶细胞2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。3、将病毒DNA转运至宿主细胞核4、病毒DNA整合到宿主染色体5、以病毒DNA为模板转录RNA6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。第59页,共73页，2024年2月25日，星期天逆转录病毒病毒RNA宿主细胞RTRT逆转录酶cDNA双链插入基因组DNA逆转录病毒感染过程病毒RNA第60页,共73页，2024年2月25日，星期天构建逆转录病毒载体：（1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。（2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。（3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。（4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。第61页,共73页，2024年2月25日，星期天逆转录病毒载体的缺陷：1、只能转染处于增殖状态的细胞2、所携带的外源基因不能太大。3、感染依赖靶细胞表面受体的限制4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成野生型病毒爆发。5、有致细胞癌变的可能。6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。第62页,共73页，2024年2月25日，星期天腺相关病毒(AVV)一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需要其他基因才能复制。结构：rep基因－－编码病毒的复制、整合功能所需蛋白

cap基因－－编码病毒结构组分

ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和结束，制约DNA序列大小，包裹入衣壳。细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。第63页,共73页，2024年2月25日，星期天骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞选择原则:1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输回体内。2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年，至病人的整个生命。3、易于受外源遗传物质的转化。4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异性的细胞3、选择靶细胞（禁止使用生殖细胞，只能用体细胞）第64页,共73页，2024年2月25日，星期天1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。