遗传标记的原理及其应用

遗传标记的原理及其应用PCR技术的产生第2页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR技术的原理PCR原理类似于DNA的体内复制。第3页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR的原理第4页,共96页，2024年2月25日，星期天第5页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR循环–第一步–加热变性第6页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR循环—第二步—引物与靶序列退火第7页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR循环-

第三步-

引物延伸第8页,共96页，2024年2月25日，星期天第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列第9页,共96页，2024年2月25日，星期天No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824第10页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火第11页,共96页，2024年2月25日，星期天第12页,共96页，2024年2月25日，星期天特异性强：引物与模板DNA按照碱基互补配对原则结合，耐热DNA聚合酶使整个反应可在较高温度下进行，结合的特异性大大提高。灵敏度高：理论上可从100万个细胞中检测出1个靶细胞简便迅速：一个PCR反应约需要2～4小时，扩增产物可直接电泳分析，直观、便捷。对模板要求低：不需特殊方法分离病毒、细菌或培养细胞，DNA粗制品即可作为扩增的模板PCR技术的特点第13页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR扩增过程图示第14页,共96页，2024年2月25日，星期天平台效应“平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。第15页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR反应成分DNA聚合酶dNTPs模板引物第16页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR反应系统的组成10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul

一、PCR反应的标准体系第17页,共96页，2024年2月25日，星期天二、关于缓冲系统10×扩增缓冲液的成分通常含有适量的KCl,MgCl2,Tris-HCl。Tris缓冲液是一种双极化离子缓冲液，它能有效地调节pH，使其维持在DNA聚合酶活性所要求的偏碱性环境；镁离子是DNA聚合酶的活性所必须的，它既影响到反应的扩增效率，也影响反应的特异性，过量的镁离子常常引起非特异性扩增反应；KCl的作用是促进引物退火。第18页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR反应中的模板可以是来源于任何生物的单链及双链DNA。PCR对模板纯度要求不高。样品中存在一定量的蛋白质或有机物对实验结果影响不大，甚至可以将细胞裂解物直接用于扩增，有DNA部分降解的样品，也可以作为模板使用。但是样品中不能含有某种可抑制DNA聚合酶活性的杂质。PCR反应中，起始模板的用量，理论上讲可以少到仅有一个有效的单一分子。为了获得高质量和高效率的扩增，模板用量可为纳克或微克水平。三、关于模板第19页,共96页，2024年2月25日，星期天引物引物3’5’5’5’基因组第20页,共96页，2024年2月25日，星期天引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性引物长度：15－40bp，常用为２０bp左右引物过短或过长均可使反应的特异性下降。四、关于引物－引物的设计原则(Cont.)第21页,共96页，2024年2月25日，星期天引物的碱基尽可能随机发布避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40％－６０％之间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。引物内部应避免形成二级结构特别是引物的末端应避免有回文结构。四、关于引物－引物的设计原则(Cont.)第22页,共96页，2024年2月25日，星期天二个引物不应有互补序列特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。引物5’末端碱基无严格限制在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。四、关于引物－引物的设计原则(Cont.)第23页,共96页，2024年2月25日，星期天3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记第24页,共96页，2024年2月25日，星期天引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。四、关于引物－引物的设计原则(Cont.)第25页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR扩增条件变性退火延伸始变性９４度５分钟主循环９４度１分钟５０度１分钟７２度１分钟终延伸７２度１０分钟一、PCR热循环中的标准参数主循环周期通常选定为25～30个循环。循环周期较多，可能获得较多的产物，但随之而来的碱基错配的概率也会增大，故在要求高保真扩增的实验中，应尽可能用较少的循环周期。第26页,共96页，2024年2月25日，星期天1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第27页,共96页，2024年2月25日，星期天试验者应根据自己的引物Tm值及实验目的进行设定退火温度，退火时间选择范围是３０秒到１分钟。延伸温度通常变化不大，延伸时间应该根据欲扩增的靶序列的长度进行调整，一般按每分钟合成１０００个碱基的速率来计算，二、关于退火和延伸第28页,共96页，2024年2月25日，星期天分析PCR扩增产物的最常用方法是凝胶电泳分析法。带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。凝胶电泳分析包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度高，但操作复杂。PCR扩增产物分析第29页,共96页，2024年2月25日，星期天第30页,共96页，2024年2月25日，星期天第31页,共96页，2024年2月25日，星期天电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。一、电泳的原理第32页,共96页，2024年2月25日，星期天核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基团带有负电荷，因此当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。在凝胶浓度和电场强度一定的情况下，DNA分子的这种迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移快，双链环状DNA比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些，这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。一、电泳的原理第33页,共96页，2024年2月25日，星期天二、琼脂糖浓度的选择片断大小琼脂浓度（％）５０～５００2.0５００～１０００1.5１０００～５０００1.0>５０００0.6第34页,共96页，2024年2月25日，星期天三、关于EBEB是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶中的核酸分子。当把含有DNA分子的凝胶浸泡在EB的溶液中，或是将EB直接加到DNA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位同DNA分子结合，然而却不能同琼脂糖凝胶结合，因此在紫外光的照射下，只有DNA分子通过放射荧光而变成可见的谱带。而且在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。换言之，在一定程度上，电泳谱带的荧光强度是同DNA片段的大小成正比的。第35页,共96页，2024年2月25日，星期天第36页,共96页，2024年2月25日，星期天EB染色原理第37页,共96页，2024年2月25日，星期天四、电泳系统—电泳仪第38页,共96页，2024年2月25日，星期天四、电泳系统—电泳槽垂直电泳槽水平电泳槽第39页,共96页，2024年2月25日，星期天第40页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物Buffer94oC5’基本过程第41页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次第42页,共96页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)第43页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题问题一：无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；第44页,共96页，2024年2月25日，星期天

问题二：非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第45页,共96页，2024年2月25日，星期天引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

问题二：非特异性扩增第46页,共96页，2024年2月25日，星期天

问题三：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12第47页,共96页，2024年2月25日，星期天模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

问题三：拖尾第48页,共96页，2024年2月25日，星期天

问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物第49页,共96页，2024年2月25日，星期天

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)第50页,共96页，2024年2月25日，星期天PCR反应的类型一、锚定PCR（anchoredPCR）用于在体外扩增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必须预先知道欲扩增DNA片段两侧的序列，但人们经常需要分析一段序列未知的基因片段，可利用锚定PCR。第51页,共96页，2024年2月25日，星期天一、锚定PCR（anchoredPCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列

对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？第52页,共96页，2024年2月25日，星期天该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，扩增带有同聚物尾的序列。锚定引物PCR对分析未知序列基因有特殊价值一、锚定PCR（anchoredPCR）第53页,共96页，2024年2月25日，星期天cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第54页,共96页，2024年2月25日，星期天目的：扩增产生特异长度的单链DNA在扩增循环中引入不同引物浓度，一般用二种不同浓度的引物，50－100：1比例的引物浓度，在最初10－15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。单链DNA可用作杂交探针或DNA测序。二、不对称PCR（asymmetricPCR）第55页,共96页，2024年2月25日，星期天

高浓度引物低浓度引物第56页,共96页，2024年2月25日，星期天常规PCR可扩增位于二个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。三、反向PCR（inversePCR）已知序列未知序列未知序列第57页,共96页，2024年2月25日，星期天已知序列未知序列未知序列限制酶连接酶限制酶第58页,共96页，2024年2月25日，星期天多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southernblotting一样可靠，但多重PCR会检测小片段缺失四、多重PCR（multiplexPCR）第59页,共96页，2024年2月25日，星期天电泳引物用于检测特定基因序列的存在或缺失第60页,共96页，2024年2月25日，星期天或称荧光PCR(fluorescentPCR)

在多重PCR试验中，一次试验还不容易区分长短相近的多种基因成分。荧光PCR可用于解决这一问题。原理：用不同的荧光染料（如红色的罗丹明、绿色的荧光素）标记不同的引物的5’端，同时扩增多个DNA区段，反应完毕后，凝胶过滤除去多余的引物进行电泳。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色，据此可以很快诊断是否某种基因缺失，或是发现某些感染的病毒等。五、着色互补PCR（colorcomplementationPCR）第61页,共96页，2024年2月25日，星期天病毒1病毒2病毒3病毒4

利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分第62页,共96页，2024年2月25日，星期天标记引物ＰＣＲ观察第63页,共96页，2024年2月25日，星期天先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。应用：①分析基因的转录产物②克隆cDNA及合成cDNA探针，改造cDNA序列等六、反转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）第64页,共96页，2024年2月25日，星期天RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNADNA聚合酶双链DNA第65页,共96页，2024年2月25日，星期天基因mRNA蛋白质多肽链第66页,共96页，2024年2月25日，星期天七、原位PCR

原位聚合酶链式反应（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。

直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列第67页,共96页，2024年2月25日，星期天

原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。

ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。第68页,共96页，2024年2月25日，星期天操作步骤细胞或组织的固定

PCR扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物第69页,共96页，2024年2月25日，星期天人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片第70页,共96页，2024年2月25日，星期天实时荧光定量PCR技术

(RealtimeQuantitativePCR)

第71页,共96页，2024年2月25日，星期天实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法第72页,共96页，2024年2月25日，星期天常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析第73页,共96页，2024年2月25日，星期天优缺点比较常规vs实时实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板通过终产物定性分析模板浓度计算机自动纪录分析检测方法费时费力第74页,共96页，2024年2月25日，星期天优势来自：实验数据及定量分析方法荧光实时监测产物浓度常规vs实时第75页,共96页，2024年2月25日，星期天Real-timePCR的定量原理介绍四个概念：

扩增曲线、荧光阈值、

Ct值、标准曲线第76页,共96页，2024年2月25日，星期天扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；

纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件一、扩增曲线第77页,共96页，2024年2月25日，星期天荧光信号阈值（threshold）：以PCR反应前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值定义为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍真正的信号:荧光信号超过域值二、荧光阈值第78页,共96页，2024年2月25日，星期天Ct值的定义：含义为在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。实际应用中，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经过的扩增循环次数三、Ct值（阈值循环数）第79页,共96页，2024年2月25日，星期天C(t)valueCt值的确定：阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是CT值。第80页,共96页，2024年2月25日，星期天横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却极具重现性是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比。第81页,共96页，2024年2月25日，星期天理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率四、Ct值与模板起始拷贝数的关系第82页,共96页，2024年2月25日，星期天在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)

Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量四、Ct值与模板起始拷贝数的关系第83页,共96页，2024年2月25日，星期天五、标准曲线每个模板的Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系利用已知拷贝数的标准品可作出标准曲线获得未知样品的Ct值，可从标准曲线得到模板的起始拷贝数第84页,共96页，2024年2月25日，星期天将标准品稀释几个浓度，Real-timePCR后得到标准曲线确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量六、绝对定量Sample25第85页,共96页，2024年2月25日，星期天SYBRGreen法TaqMan法Molecularbeacon法(分子信标)Real-timePCR的几种方法介绍第86页,共96页，2024年2月25日，星期天DNA产物的荧光标记非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

第87页,共96页，2024年2月25日，星期天实时荧光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen第88页,共96页，2024年2月25日，星期天一、工作原理SY