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文档简介

实验六

诱导细胞融合——聚乙二醇法细胞生物学实验细胞融合可在自然条件下或利用人工条件(生物的、物理的、化学的)下进行聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合,形成双核或多核细胞

通过有丝分裂，细胞核便发生融合，形成杂种细胞。细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象。细胞融合已成为研究细胞遗传、细胞免疫，肿瘤及细胞工程的重要手段了解细胞融合的原理掌握用PEG诱导细胞融合的方法

材料：鸡,兔混合全血

试剂50%聚乙二醇(PEG,MW=4000)

GKN液Hanks溶液生理盐水0.2%次甲基蓝溶液抗凝剂:肝素溶液(250μg/ml)或Alsver液器材：显微镜，离心机，水浴锅，电炉，量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯，吸管，载玻片，盖玻片等。鸡血准备：用注射器吸入1mLAlsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注入刻度离心管内，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。兔血准备混合血液取抗凝全血1mL，移入10mL离心管，

加入4mL0.85％生理盐水混匀,洗涤,1500r/min离心5min。重复洗涤2次收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量的GKN液或Ringer溶液，按压积红细胞体积配成5％的红细胞悬液。取悬液1mL到试管中，加入37℃预热的50％PEG0.8mL边加边摇动,在1min内加完,充分混匀,静置90秒.以室温为对照加入GKN或Ringer或Hanks液5ml终止PEG的作用(在30℃下完成)镜检镜检取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片,观察细胞融合状况.取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上,再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,盖上盖玻片,观察细胞融合状况计算融合率(%)融合率=融合细胞数/总细胞数×100%观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。

PEG诱导,0.2%次甲基蓝染色,鸡血细胞融合情况以肝素抗凝血取代原方法中Alsver液镜检时以凹玻片取代普通载玻片准确区分细胞融合还是细胞重叠进行染色处理提高分辨力利用光学显微镜或倒置显微镜(高倍)

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