金银花提取工艺的研究VIP

天津大学硕士学位论文金银花提取工艺的研究姓名：李莉申请学位级别：硕士专业：化工过程机械指导教师：谭蔚20070101中文摘要本文对金银花药材分别采用煎煮法、乙醇回流提取法与超声波辅助提取法进行了实验研究，应用高效液相色谱质谱联用一紫外分光检测器对绿原酸含量进行定量分析；计算出绿原酸的提取率，并考察了每种提取方法的工艺参数对提取效果的影响。正交试验设计结果表明，在煎煮法中影响出膏率和绿原酸提取率的主要因素是提取液pH值，提取温度，预浸泡，溶媒用量和提取时间。乙醇回流法中的主要影响因素是乙醇浓度，提取液pH值，溶媒用量和提取时间。由单因素实验结果可知，在酸性条件下有利于绿原酸的提取。在本实验范围内，煎煮法中的最佳提取温度为70，回流法中的溶媒(乙醇水溶液)的乙醇体积分数最佳值为70。研究表明，超声场对中药提取过程有强化作用，超声波空化效应对提取绿原酸有较大影响。从正交试验设计结果得到，超声功率和乙醇浓度是影响出膏率和绿原酸提取率的主要因素。在本实验范围内，超声波辅助提取在酸性条件和超声功率为100Wg。时，可达到最佳效果。对比三种实验方法可以看出，超声波辅助提取工艺中绿原酸提取率由煎煮法和乙醇回流提取法的3546 mgg-1和4129 mgg-1上升到5923 mgg-1，提取时间由传统工艺的25h缩短到lh。因此超声波辅助提取是一种较佳的提取工艺。在本实验范国内，超声波辅助提取工艺的最佳提取条件是：药材粉碎20目，未预浸泡，超声功率为100Wg，乙醇浓度为70，溶液pH值调至40，溶媒用量16倍于药材的质量，提取2次，每次30min。本文的研究结果为绿原酸的提取和生产中的应用提供了理论基础。关键词：绿原酸超声波辅助提取金银花超声功率正交试验ABSTRACTExtracting techniques of honeysuckle were experimentally studied by usingwater-extraction，alcoh01extraction and ultrasonic-assisted extraction 00AE)Thechlorogenic acid was extracted from honeysuckle and its content was analyzed withthe LC。MSMS methodWith the gained results the yield was calculated and thetechnical parameters which could influence the extracting effects were discussedThe factors of extracting solutions pH，extracting temperature，presoakage，alcohol dosage，extracting time in water-extraction method and the factors of alcoholconcentration，extracting solutionS pH，alcohol dosage，extracting time inalcoh01extraction were the main effect factors。to the honeysuckle paste andchlorogenic acid yield according to the orthogonal testThe acidic condition whichwas helpful to the extracting of chlorogenic acid was gained from the univariateexperimentsUnder the conditions of experiments，the optimal temperature Was 70“Cin water-extraction method and alcohol dosage was 70in alcohol concentrationAccording to the research，ultrasonic could intensify the Chinese traditionalmedicineS extraction and ultrasonic cavitate effect had great influence on thechlorogenic acid extractionThe ultrasonic power and alcohol concentration whichwere the main factors to the honeysuckle paste and chlorogenic acid yield were gainedthrough orthogonal testUnder the conditions of experiments，the optimal extractingeffect WaS achieved with acidic and ultrasonic power 1 00 Wg-1 used in UAEBy comparing extraction yield of the above three extraction methods mentioned，the UAE method was considered as the optimal one for its higher extraction efficiency(舶m 3546 mgg-and 4129 mggto 5923 mgg。1)and little time consumption(from 25hours tO l houOUnder the conditions of experiments，the optimal extractingcondition Was without presoaked，grinded，1 00 Wg1 of ultrasonic power,70ofalcohol concentration，40 of extracting solutionS pH，alcohol dosage 1 6 times ofhoneysuckleS qualiryextracting 30 minutes and 2 times。This paper provided abundant basic theory not only内r tIle extraction but also forthe application in industry of chlorogenic acidKEY WORDS：chlorogenic acid，ultrasonic extraction technics，honeysuckle，power of ultrasonic，orthogonal design独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：耋落) 签字日期： Mp_7 年月6日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解墨童苤茎有关保留、使用学位论文的规定。特授权苤聋盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名： 磨氟导师签名薄劳h l签字日期：硼7年f月6日签字目期：加7年f月彩目第章文献综述11概述第一章文献综述中药是我国劳动人民在几千年的历史发展过程中，通过长期与疾病作斗争的实践而积累的宝贵财富，是祖国宝贵的医药遗产。建国以来中药制剂生产发展很快，从原有的汤、膏、丹、丸、散剂的基础上逐渐发展到片剂、冲剂、注射、气雾、纸膜、乳、滴丸剂等lO多种剂型。生产工艺不断革新，年生产品种达几千种之多。现代医学模式开始由单纯的治疗疾病向预防、保健、治疗、康复相结合的模式转变，博大精深的中医药日益受到世界的关注。许多西方国家已开始放宽了对中医药的限制，“回归自然”，崇尚天然药物正在成为一种世界性潮流“r2l。植物是许多天然药物的重要来源，中草药及其粗提物制剂的大量开发，使得植物药市场正以大于10的速度增长。我国加入WTO后，促进了中药行业更好的与国际接轨，有利于引进先进技术和设备，然而中药发展也面临着严峻的挑战。我国的中药企业存在一小(规模小)，二多(企业数量多，产品重复多)，三低(科技含量低，管理水平低，自动化生产低)的弊端，中药剂型落后，各个环节(药材种植，炮制，制剂，包装，运输等)缺乏国际认可的标准规范控制，提取率较低，产品质量稳定性较差等问题，与我国的中药大国的地位极不相称【3】。一些中草药由于提取工艺的落后，不仅耗时费力，而且提取效果差。诸如金银花中绿原酸的提取过程中，需要提取3h，但是提取率仅为15【3】。提取技术在中药、中药提取物、半成品及成品生产和质量控制中起着非常重要的作用，现在之所以很多质量标准无法制定，检测无法进行，主要是提取手段相对落后。长期以来形成的固有模式，设备陈旧等因素，不仅使中药的提取物粗糙，提取利用不完全，造成很大的资源浪费，而且给质量控制也带来很多的困难。中药及其产业发展即要克服面临的制约因素，革除传统中药理论与实践中的种种弊端，根本上说要实现中药现代化，引入现代科学理论，其中提取技术创新是重要内容。改革中药制剂型和生产工艺，减少药材原料的消耗，提高利用效率，走提取和纯化的道路，通过中药有效成分的浸出、分离和精制，取其精华弃其糟粕，开发出高效、优质、稳定的“三效”(高效，速效，长效)、“三小”(剂量小、毒性小、副作用小)、“三便”(贮存、携带、服用方便)的新型中药14J。要实现中药生产的专业化和现代化，首先使中药提取成为现代天然产物提取技术的一个组成部分，使各种先进的提取技术应用于中药生产中，以节约能源，第一章文献综述缩短时间，更能够提高提取效率为主要目标【3翔，从而提高中药制剂中有效成分的含量，清除杂质，保证制剂药理效应，处方的量效关系的均一和稳定，是中药生产发展的必然要求。因此中药提取技术在中药现代化生产中，尤其对于成分复杂的复方中药的生产来说就显得很重要。12金芪降糖片简述金芪降糖片(金芪片)为中国医学科学院药物研究所依据传统古方，以现代实验药理学方法进行优化组合，经临床确认为安全有效的新型复方降糖药。金芪片有以下作用：改善糖代谢，改善脂质代谢，改善机体对胰岛素的敏感性，增强机体免疫功能，而且没有毒副作用。该方以金银花为君药，取其甘寒气清、入肺胃经而善于清上焦之肺热；以黄连、黄芪为臣药，取黄连之昧甘性寒，入胃经而善清胃热，脾胃之火得去；取黄芪味甘性温，补益中气，湿气旺自能生水。三药合用，共奏清热益气之功，主治内热而兼气虚之消渴症，从而达到降糖作用【”】。为了有效控制药品质量，应对三种有效成分成分进行单独提取，主要控制其君药金银花中绿原酸的含量，因此提高金银花中绿原酸的提取率十分必要。13金银花的化学成分金银花是忍冬的花蕾。我国传统医学认为，金银花的性味是甘、寒，归经为肺、心和胃，具有清热解毒，凉散风热的功效。药理实验表明，金银花的提取物具有显著的抗菌作用，其化学成分包括挥发油、有机酸、黄酮类、皂苷类掣01。(1)挥发油成分挥发油中的化学成分因金银花的产地、品种的不同而存在差异，金银花鲜花与干花挥发油成分差异较大。鲜花挥发油大多以低沸点的不饱和萜烯类成分为主，芳樟醇的含量普遍较高；干花挥发油成分以棕榈酸为主，一般可占挥发油的26以上，芳香醇只占039以上。挥发油具有挥发性，不与水互溶，可随水蒸气蒸馏出来。(2)皂苷类金银花中有六个糖基的三萜皂苷，皂苷类化合物是糖或糖的衍生物与另一种非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的一类化合物。一般溶于水、稀醇等，难溶于亲脂性有机溶剂，并可以在含水丁醇或戊醇中溶解度较好。(3)黄酮类金银花中含有的黄酮类化合物被鉴定为木犀草素7 O aD葡萄糖苷等。一般2第一章文献综述能溶于水，稀醇和乙酸乙脂等极性溶剂中。(4)有机酸类绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、棕榈酸等均为金银花中的有机酸类成分，其中绿原酸类化合物为金银花的主要有效成分。此类化合物包括绿原酸和异绿原酸。经研究表明，绿原酸是一种苞内物质；异绿原酸为一种混合物，已发现其存在7种异构体。14绿原酸的理化性质绿原酸在植物中分布很广，从高等双叶植物到蕨类植物均有报道8-10】，主要存在于忍冬科忍冬属、菊科篙属及杜仲科杜仲属植物中，其中含量较高的植物主要有杜仲、金银花、咖啡与可可树。绿原酸为一种有机酸，是植物有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，即一分子咖啡酸与一分子奎宁酸结合而成的酯，异名咖啡鞣酸，也属于酚类化合物。分子式是C16H1809，其分子具有邻苯二酚的羧基结构，结构式见图11，分子量为3543。25水中溶解度为4，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于乙酸乙酯19。12】。ooHHoH图11绿原酸的结构式Fig1一l Chemical st九lctl】re of chlorogenic acid15提取绿原酸的一般方法金银花中主要的活性成分为绿原酸，文献表明提取绿原酸的主要方法有：(1)煎煮法f12-14】煎煮法是我国最早使用的传统浸提方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。传统水煎法具有煎煮费时、携带不便、起效缓慢、作用温和等特第一章文献综述点。(2)乙醇回流提取法【1s171应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约(12)cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约l小时，根据不同药物成分的性质选择过滤的温度，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流，分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。(3)水提石灰乳沉淀法【18,191本方法利用绿原酸的酸性特质，提取具体方法按照(1)中操作，提取液加石灰乳使绿原酸类成分生成钙盐而被沉淀。沉淀物用稀硫酸分解，又有硫酸钙产生。过滤从而得到绿原酸。(4)微波辅助萃取法f20，21】微波辅助萃取法是Ganzler于1986年首先提出来的【22】。微波提取技术主要是基于微波的热特性，而微波加热的原理有两个方面，一是通过“介电损耗”(或称为“介电加热”)。具有永久偶极的分子在2450MHz的电磁场中所能产生的共振频率高达49109次s，使分子超高速旋转，平均动能迅速增加，从而导致温度升高；二是通过离子传导。离子化的物质在超高频电磁场中以超高速运动，因摩擦而产生热效应。热效应的强弱取决于离子的大小、电荷的多少、传导性能及溶剂的相互作用等。一般来讲，具有较大介电常数的化合物如水、乙醇等，在微波辐射作用下会迅速被加热，而极性小的化合物、无静偶极的化合物(如二氧化碳和四氯化碳等)以及高度结晶的物质，对微波辐射能量的吸收性能很差，不易被加热【l引。微波处理这种方法是只适用于对热稳定的产物，如寡糖、多糖、核酸、生物碱、黄酮、苷类等中药成分2325J。(5)旋流提取法【4】采用PT-1型组织搅拌机，搅拌速度为8000rmin。药材不必预先加以粉碎。提取用水温度分别为20和100，处理时N(2030)rain。旋流法提取金盏花，对提取液中黄酮类化合物、皂苷等进行分析表明，该法的提取效率较煎煮法高。(6)渗漉法渗漉法是将中药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。小量溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗漉过程中随时白药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止，或当渗滴液颜色极浅，渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上提取完全，在大量生4第一章文献综述产中常将收集的稀渗漉液作为另一批新原料的溶剂之用，提取时间一般较长【2】。(7)超声波辅助提取法超声波是一种高频机械波，频率范围为05-60)kHz，一般高于20kHz。其主要特征是波长短，近似作直线传播，在固体和液体内衰减比电磁波小，其传播特性和媒质的性质密切有关。能量集中，能形成高的温度，产生剧烈振动，引起激震波、波体中的空化作用等，结果产生机械、热、光、电、化学及生物等各种效应。对于溶媒的选择，由于水的表面张力相对来讲比较大，因此它是一种效果很好的空化液，若在水中加入乙醇，则空化效果就更好些，掺乙醇会使水的饱和蒸气压大大增加，但同时也会使表面张力下降，不过有饱和蒸气压增大给空化带来的益处远远大于由于表面张力下降所带来的不利效果。且超声波的热效应使水温基本在57，对一些热敏性物质的提取提供了良好的条件。用此法可以大大提高提取收率，缩短提取时间，并且能很好地保持提取物的特性和品质(311。本法已经在生物碱类、有机酸类的提取中得到应26-321。16影响中药提取的因素由于中药原料品种繁多，其组织和成分又极其复杂，造成多个因素影响中药提取过程中的效率。概括起来包括：被提取物质的理化性质，预处理方法，提取条件等。161被提取物质的理化性质被提取物质的理化性质包括原料结构和原料的化学性质。原料结构：提取溶媒通过多孔的细胞壁进行提取时，溶媒和以分子状态散于溶媒中的化学成分很容易通过薄膜细胞膜溶出。原料的化学性质：由于扩散系数与扩散物质的分子半径成反比，因此在提取过程中，原料中可溶性化学成分分子的半径大小不同，其扩散速度也必然不同。在溶解度相同情况下，分子小的化学成分先溶解，先扩散；大分子成分则后溶解，后扩散。扩散的条件还在于其溶解度的大小。易溶性的化学成分，即使分子大也能尽先扩散。162预处理方法(1)粉碎粉碎是用机械方法把物料制成适当程度的碎块或细粉的操作过程。多数中药材是植物或动物性的生药，这些生药的细胞组织很紧密，细胞壁也很厚，使溶剂第一章文献综述不易渗透或扩散，有效成分或该溶媒中的可溶物很难被浸出来。中药材粉碎是为了增加药材的表面积，使中药材中的有效成分更易浸出，提高浸出速度。但是粉碎的程度也有影响，粒度过小，也会产生负面作用。粉碎度的选择与浸取的方法与设备，浸出溶剂，药材的种类，组成成分等有关f21。(2)预浸泡中药材的待加工状态多数是干燥状态，在正式浸取前予以适当的浸泡，吸收溶媒，使之组织浸润膨胀，将有利于浸取时溶质的加速溶解和扩散。因为浸取时大多数情况下温度较高，如果中药材原料直接与热溶媒接触，会使表面的蛋白质层受热凝固，从而妨碍后续溶媒对细胞组织的渗透浸润，因此用冷溶媒浸泡待提取原料将会避免这一弊端【21。163提取条件(1)提取液的pH值在中药材浸提过程中，往往根据需要调整浸取溶剂的pH值，以利于某些有效成分的提取，增加制剂的稳定性。如用酸性溶媒提取有机酸，用碱性溶媒提取皂苷等。常用的辅助剂有酸、碱、酶及表面活性剂等【41。浸提溶剂中加碱的目的是增加有机酸、皂苷、黄酮、葸醌和某些酚性成分的溶解度和稳定性。例如在浸提甘草时加入少许氨水，能使甘草酸形成可溶性铵盐，保证甘草酸的完全浸出。常用的碱为氢氧化铵(氨水)，因为它是弱碱，对成分的破坏较弱，易于控制其用量，且加热后即可除去，不产生残留。有时也选用碳酸钙、氢氧化钙、碳酸钠等。浸提溶剂中加酸的主要目的：一是使有机酸游离，便于用有机溶剂浸提，除去酸不溶性杂质等；二是促进生物碱的浸出，提高部分生物碱的稳定性。常用的酸有硫酸、盐酸、醋酸、酒石酸等。通常使用10以下的稀酸操作，维持需要的pH值，否则会导致成分的破坏或水解。文献表明【3134】，在弱酸性条件下，咖啡酸和鞣酸较易合成为绿原酸。(2)提取温度溶质在溶剂中的溶解速度及溶解度随温度升高而增加，扩散系数亦随温度升高而增加，故随温度的升高提取速度和提取收率均有提高。同时随温度的升高，杂质混入增多，热敏性组分可能被分解破坏，易挥发性组分损失加大。提取操作时对温度要进行适当的控制。(3)提取时间被浸出物质在不同的浸出时间内其浸出量是不同的。开始是由于药材内部和浸出溶剂之间的浓度差比较大，扩散速度快、浸出速度也较快。随着时间的延长，6第一章文献综述浓度差趋于缩小，浸出速度逐渐降低，最终达到扩散平衡状态。一方面浸出时间越长，则浸出物的浸出越充分，越彻底，从表面看似乎是有利的，另一方面，当药材中被浸出物的含量降低到一定程度后仍然延长浸取过程，则此后实际得到的有效物质是极少的，反而使各方面消耗增加，设备利用率降低。有效成分长时间受热会导致生物活性的破坏，大量杂质成分溶出，结果得不偿失。因此浸出时间要控制适当，要根据具体情况而有所增减【27】。(4)溶媒的选择溶媒的性质不同，对各种化学成分的溶解性不同，提取出的化学成分也不一样，因此，选择合适的提取溶媒，与提取效果及针剂质量关系密切。理想的提取溶媒应符合下列条件：能最大量的提取中草药的有效成分，而不提取或极少量提取杂质：性质稳定，不应与有效成分发生化学反应；廉价易得，或可以回收；使用方便，操作安全。目前在配制中药针剂中，常用水和乙醇作提取溶媒踟。(5)溶媒用量与提取次数溶媒选定后，溶媒用量和提取次数对提取效果也有很大影响，对浸取物的质量和收率以及能耗有极大影响。在中药浸出生产过程中，要用最少量的溶剂，得到最高的浸出药量。通过固定药液量控制加水量，即药液量=加水量一方药总吸水量一蒸发量，所以只要解决方药总吸水量和蒸发量再由固定的煎药液量，就可得出提取时的加水量，首次提取时的药液量应大于有效溶质溶解所需的溶媒量。对于具体的提取设备，单位时间的水蒸发量是可知的，单位方药饮片的吸水量也可通过实验测定。显然，在定量溶媒的情况下，多次提取较一次提取可提高浸出率。但不适当地增加次数对生产又将增加能耗，而且溶媒用量和提取次数还受药材性质和状态的影响。17研究目的与研究内容171研究目的对于绿原酸的提取，目前采取煎煮法和回流提取法。对于煎煮法研究最多的因素为：提取次数和第二次提取时间，对这些因素有较为明确的结论，但是对于pH值，溶媒用量，提取温度等因素对绿原酸提取的影响还没有定论【坦14】；而回流提取法中研究对乙醇浓度，pH值，溶媒用量对绿原酸提取的影响得到的结论相差较大I盼171。石灰乳提取法中虽可以利用沉淀物来获取绿原酸，但是绿原酸损失较大f18例。针对金芪降糖片的现行的提取工艺及单方提取的弊端，本课题对金银花进行第一章文献综述提取，以金银花的有效成分绿原酸的提取率和出膏率为考察指标，分析研究不同提取方法的提取机理，优选出提取工艺，并提出适宜的提取条件。172研究内容本课题采用煎煮法、乙醇回流提取法、超声波提取三种方法对金银花进行提取，以出膏率和绿原酸提取率为考察指标，应用高效液相色谱质谱对绿原案的含量进行分析。主要研究内容为：(1)煎煮法实验考察预浸泡，第一次提取时间，溶剂pH值和提取温度对指标的影响；通过正交试验和单因素实验确定煎煮法提取绿原酸的最佳工艺。(2)乙醇回流提取实验考察乙醇浓度、溶媒用量和溶剂pH值对指标的影响；通过正交试验和单因素实验确定乙醇回流提取绿原酸的最佳工艺。(3)超声波辅助提取实验分别考察药材粉碎粒度和提取时间对指标的的影响；考察预浸泡、超声功率、超声作用时间、乙醇浓度、溶媒用量和溶媒pH值对指标的影响：通过正交试验和单因素实验确定超声波辅助提取绿原酸的最佳工艺。(4)综合评价以绿原酸得率，出膏率，能耗，溶媒用量，提取时间等因素为评价指标综合评价煎煮法，回流提取法和超声波辅助提取法在绿原酸提取上的优劣，为中药现代化的工业生产提供实验依据。第二章提取实验原理第二章提取实验原理21金银花的显微特征图21金银花粉末图Fig2-1 Powder ofhoneysuckle1腺毛2厚壁非腺毛3薄壁非腺毛4草酸钙簇晶5花粉粒金银花粉末如图21所示。金银花粉末是花状结构，质地较松散。干燥的金银花粉末呈现黄色【351。在提取过程中，绿原酸从细胞内浸出，需通过腺毛，厚壁非腺毛等结构进入到溶液中。因此选择不同的提取工艺和提取条件，对绿原酸的浸出有很大的影响。22绿原酸的生成过程(1)化学合成Panizzi等人【251首次以奎尼酸为原料经七步用化学方法合成出绿原酸，总产率很低(5)，随后Hem merle等人【26】在改进奎尼酸羧基的保护方法，将总产率提高至U(22-32)。近期Michael Sefkowl271报道了从奎尼酸四步合成绿原酸，总产率高到65，具体路线见图22：9第二章提取实验原理族OH中问体(1)中问体(2)Ac20(COCl)2中r-j体(1)中间体(2)图22绿原酸的化学合成Fig。2-2 Chemistry synthesis of the chlorogenic acid绿原酸(2)绿原酸的生物合成植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下，葡萄糖转