喜树碱及其衍生物提取工艺进展研究

1喜树碱及其衍生物提取工艺进展研究朱宏宇（西南林业大学，云南昆明）摘要：喜树碱(CPT)是一种细胞毒性喹啉生物碱,可以抑制 DNA 酶拓扑异构酶 I.1966 年，M.E. Wall 和 M.C. Wani 等从喜树植物中分离出喜树碱并认为其是一种天然的抗癌药物。实验室提取喜树碱及其衍生物的方法多为乙醇为溶剂，使用微波法、浸提法、超声波法或匀浆提取法从树木的叶子中提取喜树碱及其衍生物。有研究通过正交试验对提取温度、提取时间以及匀浆时间对提取效率的影响进行了分析。笔者将从简单综述以上多种喜树碱及其提取工艺，并简述各种工艺操作的优缺点。关键字：喜树碱；提取工艺；研究进展Research of Extraction Methods for Camptothecin and its derivatives from Camptotheca acuminata Abstract: Camptothecin (CPT) is a cytotoxic quinoline alkaloid which inhibits the DNA enzyme topoisomerase I (topo I). It was discovered in 1966 by M. E. Wall and M. C. Wani in systematic screening of natural products for anticancer drugs. Using ethanol as solvem, 4 metllods including stirring extraction，homogenate extraction，ultrasonic extraction or microwaveassisted extraction were adopted to extract 2camptothecin and its derivatives from Camptotheca acuminata.Studies through the orthogonal experiment of extracting temperature, extracting time and the influence of homogenate of time on the extraction efficiency were analyzed.The author will from simple overview over a variety of camptothecin and its extraction technology, and describes the advantages and disadvantages of various process operations.Key words:camptothecin; Extraction process; Research progress喜树碱(Camptothecin，CPT) 喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)为山茱萸目(Cornlales)珙桐科(Nyssaceae)旱莲属植物。1966 年，自 M.E. Wall 和 M.C. Wani 等从喜树植物中分离出喜树碱以来，国内外对喜树碱和 10 一羟基喜树碱的提取研究已有许多报导。1976 年中国化学家高怡生等合成消旋喜树碱成功。喜树碱是从产于中国的喜树( 喜树，幸福树) 树皮和叶子中分离出来，早期为传统中医疗法治疗癌症的方法。喜树碱在初步临床试验有显著的抗癌特性、溶解度低以及含有高度的药物不良反应特性15 。药用化学家进而利用这些特性开发出了多样的合成3喜树碱和各种衍生品，以增加良好的效果。现今已有两个喜树碱的类似物批准，并为癌症进行化疗，如拓扑替康和伊立替康。关于喜树碱和 10 一羟基喜树碱提取方法的报道很多有研究表明以体积分数 55左右的乙醇溶液为溶剂610 。提取喜树碱和及其衍生物效果最佳。简述浸提法、超声波提取法、匀浆法和微波处理提取喜树中喜树碱和 10 一羟基喜树碱。1.材料和方法1.1 实验材料出生的喜树碱嫩叶为实验原料，在60进行烘干至恒重，之后粉碎研磨处理，粉碎过50目筛，称取若干份。试剂：试剂均达到分析纯，采用蒸馏水。仪器：匀浆机、分光光度计、红外色谱仪、高效液相色谱仪、天平、离心机等1.2 方法121 喜树碱和衍生物A. 超声波提取法：称取 1.00 克喜树叶子粉末，溶于 20mL 55%乙醇溶液，在 30，40000Hz 条件下，分别超声波提取 15、30、45、60 分钟。B. 浸提法：称取 1.00 克 喜树叶子粉末，溶于 20mL 55%乙醇溶液，在不同温度下（50、60、70）浸没提取喜树碱及其衍生物。C. 匀浆提取法：匀浆机处理喜树叶粉末，称取 1.00 克喜树叶子粉末，溶于 20mL 55%乙醇溶液，在 30匀浆提取处理喜树碱。4D. 微波提取法：称取 500 g 喜树嫩叶粉末(过 50 目筛)，溶于100 mL55的乙醇溶液中100 W 功率下微波 l min。然后立刻冷却2 min。如此反复微波提取 3 次。将各种方法所得的提取液 10 000 rmin 离心 10 min上清液过 046 恤 m 滤膜后进样检测。122正交试验优化喜树碱提取方法称取样品100 g，溶于20 mL 55的乙醇溶液中，匀浆后浸提30 min,然后超声波处理提取喜树碱,设计3因素3水平正交试验。以喜树碱和其衍生物的收率为指标，考察匀浆时间、浸提温度和超声波时间对提取效果的影响(表1)。123喜树碱衍生物的测定1)高效液相色谱条件。色谱柱：XTerra RPl8 柱(5m，4.6 mm250 mm)：流动相:体积比 20:80 的乙腈水混合液；入射波长：550 nm；激发波长：363 mm；流速：1 mLmin；进样量：lOL；柱温：30。2)标准曲线的制备。精确称取 111 mg 10 一羟基喜树碱和 103 mg 喜树碱标准样品于 50 mL 的容量瓶中,用无水乙醇溶解,定容至刻度线。将上述标准样品按梯度稀释，进样量 10L，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归,得标准曲线方程：喜树碱Y1=(1E+06)X+241384 r=0.9999；lO-羟基喜树碱 Y2=(9E+06)X+553 5466，r=1.0000。喜树碱和 10 一羟基喜树碱分别在010351500 和 0.111。11.100gmL 时，浓度与峰面积具有良好的线性关系。 按照上述喜树碱及其衍生物标准品的检测条件，分别测定 121 和 122 所得提取液中喜树碱和 10 一羟基喜树碱的含量并计算喜树碱和 10-羟基喜树碱的提取率。2 结果与分析21 温度对浸提法提取喜树碱及其衍生物提取效率的影响浸提温度对喜树碱及其衍生物的提取率有一定影响(表2)，70过夜浸提喜树碱提取率最高但此时10-羟基喜树碱的提取率低于50和60时的提取率。超声处理能在短时间内提高浸提的效率。70时浸提30min结合超声处理30min10-羟基喜树碱的提取率与50和60时过夜浸提的提取率相同。喜树碱的提取率略低于过夜浸提时所得提取率相同，说明超声处理能有效缩短浸提时间。2.2 超声时间对喜树碱和10-羟基喜树碱提取率的影响超声提取时间对喜树碱和10-羟基喜树碱提取率的影响不同(表3)。随着超声时间的延长，10-羟基喜树碱的提取效率在45 min内基本没变化。但当延长至60 min时，其提取率为超声45 min时提取率的2倍多。喜树碱提取率则随超声时间的延长呈先上升后下降的趋6势。超声时间为30 min时提取率最大。23 匀浆时间对喜树碱及其衍生物碱提取率的影响匀浆时间长短对10一羟基喜树碱提取率的影响不大，而喜树碱的提取率随着匀浆时间的延长而增加(表4)。24 正交试验结果根据正交试验结果。各因素对 10 一羟基喜树碱提取率的影响顺序为：提取温度、匀浆时间、超声波时间，对喜树碱提取率的影响顺序为：提取温度、超声波时间、匀浆时间(表 5)。提取 10-羟基喜树碱的最优方案为 A3B2C2；即匀浆 12min，60浸提 30min，超声波处理30min;提取喜树碱的最优方案为 A3B2C1,即匀浆提取 12min，60水浴 30min，超声波处理 15 min,喜树碱的提取率可达 O.33845,明7显高于单独使用 4 种方法中任何 1 种所得的提取率。3 讨论与总结通过单因素试验和正交试验优化喜树碱及其衍生物的提取方案,结果显示,单一提取方法中,浸提法过夜提取喜树碱及其衍生物的提取率均达到最高，但该法耗时长、耗能大。正交试验结果表明不同因素对喜树碱及其衍生物影响大小不同。提取温度对其提取率都很重要。而匀浆时间对喜树碱和 10-羟基喜树碱提取影响略有差异。可能与 2 种化合物的化学结构差异有关。另外，多种提取方法同时使用能有效节省提取时间。提高提取效率。参考文献1关水，安丽佳喜树碱生物合成途径及其代谢调控的研究进展J高技术通讯，2004(5) ：106_1102TAN C，CAI LQ，WU W，et 81NSC606985，B novel 8cptotlIecinaIlalog，arresttate tumr sJCeer Chemother Phmcol，2009，63(2)：3033123LEE D H，KIM S W.SUH C，et a1Belotecncecin； is active in pmient8 with small lungcer：Re8ult8“a multicenter early II 8tudyJAnnal8 of Oncology，2008，19(1)：1231274WANG L M，UQY，ZUYG，et a1Altiprolifeve andpapoptotic effect,a novel in anadog,colon lineJ-ChemicoBiol calInteractions，2008，176(23)：1651725PING Y H，LEE H C，LEE J Y，eta1Anticancer efects flowhydroxyc ptothecin in hurn colon cancerJOncol Rep2006，15(5)：1273 12796ZNG w，s0NG J J，MU L Y et a16